Microbiologia

UNIVERSIDAD PERUANA CAYETANO HEREDIA
FACULTAD DE CIENCIAS Y FILOSOFIA
DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA, BIOLOGIA MOLECULAR Y FARMACOLOGIA
PRACTICAS DE LABORATORIO DE BIOQUIMICA
2007

2 de Noviembre 2007
Patricia Herrera Velit

PRECIPITACIÓN DE PROTEINAS

Resumen: Precipitación etanólica de un excretado/secretado de Fasciola hepatica conteniendo actividad proteolítica. Se haráprecipitaciones con tres concentraciones finales de etanol y la actividad enzimática, así como la concentración de proteínas, será analizada en cada precipitado y en uno de los sobrenadantes de la precipitación.

F. hepatica es un tremátode que posee un ciclo de vida tal como se muestra en la Figura inferior:

[pic]

Las metacercarias son las formas infectivas para herbívoros como el ganado vacuno, ovino,camélidos sudamericanos, entre otros, y también para los humanos. Una vez ingeridos junto con vegetales de agua dulce como berros o alfalfa, las metacercarias se desenquistan y migran por el intestino llegando finalmente a los conductos biliares. En este proceso el parásito secreta enzimas digestivas tales como proteasas que le servirán para su alimentación y para contrarrestar las defensas delhospedero. Estas enzimas pueden digerir hemoglobina, colágeno, así como inmunoglobulinas.

I. Material Biológico para la práctica:
Especímenes de F. hepatica en estadío adulto han sido colectados de un camal local y han sido cultivados en el laboratorio; luego de someterlos a un shock hipo-osmótico, se han obtenido los productos de excreción/secreción (E/S) los cuales han sido liofilizados.Este material ha sido resuspendido en buffer citrato de sodio 0.2 M conteniendo 0.1 mM HgCl2.

Procedimiento:
Identifique el vial que contiene el producto E/S de F. hepatica.

Rotule usted 3 tubos eppendorff en donde llevará a cabo la precipitación etanólica del E/S: “20,” “40” y “60”. Estos números indican el porcentaje de etanol que debe contener el vial cuando usted coloque en él, elproducto E/S y etanol absoluto.

Utilice la tabla a continuación para realizar el cálculo y úsela como guía para los siguientes pasos.

|% Etanol final |Volumen extracto |Volumen etanol |Volumen final |
|20 |? |? |1.2 ml |
|40 |?|? |1.5 ml |
|60 |? |? |1.5 ml |

Rotule también otro tubo como “Sobrenadante-60”

1. En cada uno de los tubos rotulados, coloque el volumen que ha calculado de E/S
2. Con una micropipeta, agregue lentamente el volumen de etanol frío que ha calculado.
3.Agite vigorosamente durante 15 segundos.
4. Deje reposar el tubo en hielo por 15 minutos
5. Centrifugar la muestra a 12,000 g por 5 minutos
6. Para los tubos conteniendo 20% y 40% etanol, descarte el sobrenadante, teniendo cuidado de no
alterar el precipitado que se haya formado
7. Dejar secar el precipitado sobre un papel toalla por 5 minutos, aproximadamente
8. Para el tubo conteniendoetanol al 60%, pasar el sobrenadante al tubo rotulado “Sob60”. Proceder
con el precipitado de la misma manera que para los otros tubos.
9. Resuspender el precipitado en los siguientes volúmenes:
a. Precipitado del 20%: 320 μl de citrato de sodio 0.2 M
b. Precipitado del 40%: 300 μl de citrato de sodio 0.2 M
c. Precipitado del 60%: 200 μl de citrato de sodio 0.2 MDejar reposando en frío (sobre hielo).

Preguntas para el informe:
1. ¿Qué es un shock hipo-osmótico
2. Mencione dos familias de enzimas proteolíticas y dé dos ejemplos de cada una
3. ¿Cuál es la función del HgCl2?
4. ¿En qué consiste la liofilización?

II. DIALISIS
El sobrenadante de la precipitación con 60% etanol será sometida a un proceso de diálisis con el fin de disminuir...