Microscopía electrónica

MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA:
PROCESAMIENTO DE
MUESTRAS

EL MICROSCOPIO ELECTRÓNICO:
Un microscopio electrónico es aquél que utiliza electrones en lugar de fotones o luz visible para formar imágenes de objetos diminutos. Los microscopios electrónicos permiten alcanzar una capacidad de aumento muy superior a los microscopios convencionales (hasta 2 aumentos comparados con los de los mejoresmicroscopios ópticos) debido a que la longitud de onda de los electrones es mucho menor que la de los fotones "visibles".
Existen dos tipos principales de microscopios electrónicos: el microscopio electrónico de transmisión y el microscopio electrónico de barrido.
Microscopio Electrónico de Transmisión
El microscopio electrónico de transmisión emite un haz de electrones dirigido hacia el objetocuya imagen se desea aumentar. Una parte de los electrones rebotan o son absorbidos por el objeto y otros lo atraviesan formando una imagen aumentada de la muestra. Para utilizar un microscopio electrónico de transmisión debe cortarse la muestra en capas finas, no mayores de un par de miles de ángstroms. Los microscopios electrónicos de transmisión pueden aumentar la imagen de un objeto hasta unmillón de veces.
Procesamiento de las muestras en el ME de Transmisión
La preparación de rutina de los especimenes para la microscopia electrónica de transmisión comienza con la fijación con glutaraldehído, seguida de un lavado con un buffer y de una fijación con tetróxido de osmio.
Por lo general, se fijan para el microscopio electrónico de transmisión piezas de tejido no mayores de1 mm3
El proceso de deshidratación es idéntico al empleado en la microscopia óptica
El tejido incluido en material plástico se secciona por medio de micrótomos especialmente diseñados, que usan cuchillas de diamante.
Debido al limitado poder de penetración de los electrones, el espesor de los cortes preparados para el microscopio electrónico de transmisión varia entre 50 nm y 150nm. Estos cortes son demasiado finos para poder ser manipulados; se los hace flotar desde el filo de la cuchilla en la superficie de una bandeja llena de líquido, se recuperan y se colocan en rejillas de malla de cobre recubiertas por plástico. Estas rejillas tienen 50-400 orificios por pulgada o hendiduras especiales para observar cortes seriados.
Por lo general, la coloración delos cortes para microscopio electrónico de transmisión se realiza por medio del agregado a la muestra de materiales de elevada densidad, tales como iones de metales pesados. Estos iones de metales pesados se unen a los tejidos durante la fijación o la deshidratación o al sumergir las muestras en soluciones de tales iones después del corte. El teróxido de osmio que se emplea de rutina en el fijadorse une a los componentes fosfolipídicos de las membranas, lo cual agraga densidad a la membrana.
A menudo se agrega nitrato de uranilo a las soluciones alcohólicas usadas en la deshidratación, con el fin de agregar densidad a los componentes de las uniones celulares y a otros sitios. La inmersión secuencial en soluciones de acetato de uranilo y citrato de plomo se usarutinariamente para teñir los cortes antes de observarlos con microscopio electrónico de transmisión.
La congelación-fractura es un método especial de preparación de la muestra para microscopia electrónica de transmisión, de gran importancia en el estudio de membranas.
El material a examinar puede estar fijado o no; en el primer caso se elimina el fijador del tejido por mediode lavados, antes de procesarlo. Se infiltra el tejido con un crioprotector, como el glicerol y se congela rápidamente a unos –160 grados centígrados.
Microscopio Electrónico de Barrido (MEB)
En el microscopio electrónico de barrido (MEB) la muestra es recubierta con una capa de metal delgado, y es barrida con electrones enviados desde un cañón. Un detector mide la cantidad de electrones...