No Tengo Idea
Páginas: 18 (4286 palabras)
Publicado: 19 de abril de 2012
Diseño y expresión de hPAB péptido antibiótico como multímeros tándem
en Escherichia coli
Péptidos antibióticos son pequeños péptidos codificados por el ADN genómico del organismo.
Son reconocidos a jugar un papel importante en la defensa innata del huésped de la mayoría de los organismos vivos. La creciente resistencia de las bacterias a los antibióticos convencionales y la necesidadpara el descubrimiento de nuevos antibióticos han estimulado un gran interés en el desarrollo de péptidos antibióticos como agentes terapéuticos humanos. Sin embargo, la preparación de péptidos antibióticos a gran escala es un gran desafío en el desarrollo de estos productos comerciales.
En este estudio, multímeros repeticiones en tándem de péptido antibiotico hPAB-β se han diseñado y losplásmidos recombinantes contienen entre uno y ocho copias del gen hPAB-β se generaron.
Ocho bacterias ingeniería genética albergar pQE-hPAB-β1-8 recombinante fueron capaces de expresar los multímeros hPAB-β repetitivos de interés en los cuerpos de inclusión, respectivamente. Las proteínas expresadas podría llegar a 2,6 a 28% de las proteínas totales.
El trimer hPAB-β construido fue seleccionadopara el estudio posterior sobre la base de su nivel de expresión más alta (27,8%), cuyos rendimientos en pesos de celula húmeda (3.15 ± 0.45 g / l) y proteína de fusión cuerpos de inclusión fue capaz de disolverse completamente en urea 8M .
Los trímeros tándem podría ser fácilmente capturados por cromatografía de afinidad Ni-NTA y escindido en monómeros por hidroxilamina. A continuación, elhPAB-β monómero de interés se purificó al 95% de homogeneidad mediante cromatografía de fase inversa y filtración en gel. El rendimiento final del hPAB-β monómero recombinante purificado fue de 680 ± 12 mg/100 g de células húmedas. La concentración inhibitoria mínima (CIM) del hPAB-β recombinante purificado contra el tipo o cepas clínicas de microorganismos iban desde 31-250mg / ml y losresultados obtenidos mostraron que el hPAB-β recombinante podría mantener su actividad biológica.
Introducción
La inmunidad innata proporciona organismos con una dinámica de primera línea de defensa del huésped contra los microbios. Las células epiteliales que recubren la piel de los mamíferos y las vías respiratorias son sitios cruciales en la defensa del huésped.
Una de larespuesta de defensa del huésped innata de estas células es la producción inducible de defensinas, una clase de antibióticos peptídicos homólogos que se encuentran en los leucocitos, células intestinales gránulos de Paneth y células epiteliales en una amplia distribución de los animales, incluyendo insectos, roedores y seres humanos.
El amplio espectro antimicrobiano y la fuerteactividad antimicrobiana de los antibióticos peptídicos han sido asumidas como armas potenciales para las infecciones bacterianas y fúngicas.
En la actualidad, la resistencia creciente de las bacterias a los antibióticos convencionales y la necesidad de desarrollar nuevos antibióticos han estimulado un gran interés en el desarrollo de péptidos antibióticos como agentes terapéuticos humanos.
Sin embargo,la preparación a gran escala de antibióticos peptídicos sigue siendo un gran desafío.
En la última década, varios sistemas de expresión biológica han sido desarrollados por la fusión de los péptidos antibióticos asociados con una proteína con propiedades aniónicas para evitar la toxicidad de los productos a las células huésped.
Tales integrantes de la fusión incluyen proquimosina bovina ,la proteína de unión a maltosa, F4 de Escherichia coli intracelular de proteínas PurF y proteína verde fluorescente mejorada (EGFP).
En nuestro estudio anterior, una secuencia que codifica una proteína de 16,7 kDa del fago 3 Pseudomonas aeruginosa (PAP3, el número de adhesión GenBank: AY078382) fue utilizado como molécula portadora de coexpresion con hPAB-β ,un péptido antibiótico...
en Escherichia coli
Péptidos antibióticos son pequeños péptidos codificados por el ADN genómico del organismo.
Son reconocidos a jugar un papel importante en la defensa innata del huésped de la mayoría de los organismos vivos. La creciente resistencia de las bacterias a los antibióticos convencionales y la necesidadpara el descubrimiento de nuevos antibióticos han estimulado un gran interés en el desarrollo de péptidos antibióticos como agentes terapéuticos humanos. Sin embargo, la preparación de péptidos antibióticos a gran escala es un gran desafío en el desarrollo de estos productos comerciales.
En este estudio, multímeros repeticiones en tándem de péptido antibiotico hPAB-β se han diseñado y losplásmidos recombinantes contienen entre uno y ocho copias del gen hPAB-β se generaron.
Ocho bacterias ingeniería genética albergar pQE-hPAB-β1-8 recombinante fueron capaces de expresar los multímeros hPAB-β repetitivos de interés en los cuerpos de inclusión, respectivamente. Las proteínas expresadas podría llegar a 2,6 a 28% de las proteínas totales.
El trimer hPAB-β construido fue seleccionadopara el estudio posterior sobre la base de su nivel de expresión más alta (27,8%), cuyos rendimientos en pesos de celula húmeda (3.15 ± 0.45 g / l) y proteína de fusión cuerpos de inclusión fue capaz de disolverse completamente en urea 8M .
Los trímeros tándem podría ser fácilmente capturados por cromatografía de afinidad Ni-NTA y escindido en monómeros por hidroxilamina. A continuación, elhPAB-β monómero de interés se purificó al 95% de homogeneidad mediante cromatografía de fase inversa y filtración en gel. El rendimiento final del hPAB-β monómero recombinante purificado fue de 680 ± 12 mg/100 g de células húmedas. La concentración inhibitoria mínima (CIM) del hPAB-β recombinante purificado contra el tipo o cepas clínicas de microorganismos iban desde 31-250mg / ml y losresultados obtenidos mostraron que el hPAB-β recombinante podría mantener su actividad biológica.
Introducción
La inmunidad innata proporciona organismos con una dinámica de primera línea de defensa del huésped contra los microbios. Las células epiteliales que recubren la piel de los mamíferos y las vías respiratorias son sitios cruciales en la defensa del huésped.
Una de larespuesta de defensa del huésped innata de estas células es la producción inducible de defensinas, una clase de antibióticos peptídicos homólogos que se encuentran en los leucocitos, células intestinales gránulos de Paneth y células epiteliales en una amplia distribución de los animales, incluyendo insectos, roedores y seres humanos.
El amplio espectro antimicrobiano y la fuerteactividad antimicrobiana de los antibióticos peptídicos han sido asumidas como armas potenciales para las infecciones bacterianas y fúngicas.
En la actualidad, la resistencia creciente de las bacterias a los antibióticos convencionales y la necesidad de desarrollar nuevos antibióticos han estimulado un gran interés en el desarrollo de péptidos antibióticos como agentes terapéuticos humanos.
Sin embargo,la preparación a gran escala de antibióticos peptídicos sigue siendo un gran desafío.
En la última década, varios sistemas de expresión biológica han sido desarrollados por la fusión de los péptidos antibióticos asociados con una proteína con propiedades aniónicas para evitar la toxicidad de los productos a las células huésped.
Tales integrantes de la fusión incluyen proquimosina bovina ,la proteína de unión a maltosa, F4 de Escherichia coli intracelular de proteínas PurF y proteína verde fluorescente mejorada (EGFP).
En nuestro estudio anterior, una secuencia que codifica una proteína de 16,7 kDa del fago 3 Pseudomonas aeruginosa (PAP3, el número de adhesión GenBank: AY078382) fue utilizado como molécula portadora de coexpresion con hPAB-β ,un péptido antibiótico...
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