Preparación de DNA plasmídico de Escherichia coli, Electroforesis en gel de Agarosa

Trabajo Práctico N°1 y 2, Preparación de DNA plasmídico de Escherichia coli, Electroforesis en gel de Agarosa.


INTRODUCCIÓN:
Los plásmidos son moléculas de DNA extracromosómicas presentes en bacterias y algunas células eucariotas. Los mismos no son necesarios para la vida de la célula pero pueden ayudarla a sobrevivir en condiciones desfavorables. Estas moléculas de DNA son muy utilizadasen la Biología Molecular ya que son capaces de duplicarse de modo autónomo al DNA cromosómico, aunque por esto mismo pueden perderse al cabo de sucesivas generaciones debido a que pueden competir dentro de la célula por la maquinaria replicativa (incompatibilidad plasmídica) y esto puede ser desfavorable dependiendo del experimento que se desee realizar.
En biología molecular los plásmidossuelen utilizarse para amplificar una cierta secuencia de DNA insertándola en el plásmido e incluyendo el mismo dentro de una bacteria para replicarse. También pueden utilizarse para replicar secuencias reguladoras de expresión.
El procedimiento que llevamos a cabo es el de lisis alcalina, mediante el cual, el DNA plasmídico será extraído de las bacterias que los contenían, debido a la lisis de lasmismas, así como también será purificado, al ser separado del DNA cromosómico, el RNA, las proteínas, y demás elementos presentes en las células.
Para analizar los resultados obtenidos en un experimento de extracción de DNA plasmídico, se utiliza el método de electroforesis en gel de agarosa, para observar y concluir cuales podrían ser las moléculas presentes en la solución resultante, Sirealmente se pudo purificar el plásmido deseado. Este método se basa en la carga de los ácidos nucleicos ya que lo que se utiliza es un polo negativo y un polo positivo para que los grupos fosfatos del DNA, hagan que se traslade desde el polo negativo hacia el polo positivo de una cuba a través de un gel de agarosa con un poro de tamaño determinado según lo que se desee correr (en este caso 0.8%, amenor porcentaje mas grande es el poro). La corrida del DNA en el gel depende de su tamaño, de su forma y de su relación carga/masa. A partir de la electroforesis y comparando las moléculas de DNA lineal que se ponen a correr en una de las calles (DNA plasmidico con enzima de restricción.) se puede determinar las diferentes isoformas presentes en las soluciones.
Para poder realizar el experimentode electroforesis se utilizan diferentes soluciones imprescindibles tanto para la realización como para los resultados de la misma. Durante la preparación del gel de agarosa 0,8% se utiliza bromuro de etidio, que es un compuesto fluorescente que se intercala entre las bases del DNA o RNA y se utiliza para observar las bandas de DNA en luz ultra violeta.
Para mantener la estabilidad del PH del gelse utiliza un buffer de corrida.
Para lograr sembrar correctamente la solución que se desea correr, se utiliza un buffer de siembra que contiene glicerol en su composición para impedir que la solución se derrame en toda la cuba. Este último buffer también contiene colorantes para poder controlar la corrida y evitar que el DNA salga del gel.


OBJETIVO:
Extracción de DNA plasmídico(pBluescript II SK/KS) de Escherichia coli.
Purificación del DNA extraído
Observación de macromoléculas presentes en la solución de DNA plasmídico extraído a través de la electroforesis en gel de agarosa.
Determinación del peso molecular en pares de bases de distintos fragmentos de DNA lineal.

METODOLOGÍA:
Se realizaron los pasos especificados en el protocolo de la guia de trabajos prácticos
Enel paso 6 de extracción de plásmido agregamos 0,6ml de isopropanol.
Los pasos 1 a 5 de la electroforesis fueron realizados previamente por los docentes, por lo que al comenzar con el TP contábamos con el gel ya preparado.

RESULTADOS:
Durante la extracción de DNA plasmidico de Escherichia coli luego de agregar la solución de lisis alcalina al tubo eppendorf observamos que la suspensión que...