PREPARACI N GELES AGAROSA ACRILAMIDA
Páginas: 3 (555 palabras)
Publicado: 16 de mayo de 2015
GELES DE AGAROSA:
Para separar fragmentos de ADN de mayor tamaño (entre 0,5 y 30 Kb) se utiliza electroforesis en geles de agarosa de concentración variable 0.7 - 2.5%, en solución TAE 1X(Tris-HCl 40 mM, EDTA 2 mM, Acido Acético Glacial, pH 8,0). Los geles analíticos se realizan en forma horizontal, quedando estos sumergidos, es decir, cubiertos al menos por 2 mm de solución amortiguadora deelectroforesis (TAE 1X).
Los geles se corren a 100 volt hasta la salida de la muestra del pocillo e ingreso de esta al gel, y 70 volt. para su desplazamiento a través de este. Usando TAE 1X comoamortiguador de corrida. Las muestras son cargadas en volúmenes de 6 l más 2 l de loading buffer ( Glicerol 25%, Azul de Bromofenol 0,025% y EDTA 12 mM).
El ADN se observa posteriormente en untrans-iluminador UV, luego de haber incubado el gel durante 15 minutos en una solución de Bromuro de Etidio 0,5 g/ml.
GELES DE POLIACRILAMIDA:
Para separar los fragmentos de ADN de menortamaño, se usan geles de poliacrilamida desde 5% al 10% (dependiendo del tamaño de fragmentos estudiados). La solución madre contiene 30% de acrilamida y 1% de Bis-acrilamida.
Para la preparación100 ml de solución madre (10%) se agrega Acrilamida / Bis-Acrilamida (30:1), 10 ml de TBE 10X (Tris-HCl 0,9 M pH 8,0 ; Acido Bórico 0,9 M y EDTA 20 mM pH 8,0); 36 gr de Urea y 84,4 ml de aguabidestilada. Una vez disuelto todos los componentes se procede a filtrar la solución (utilizar papel filtro de 0.2 m) posteriormente almacenar a 4 oC.
POLIACRILAMIDA 10% (100 ml)
ACRILAMIDA
9.678 gBIS-ACRILAMIDA
0.322 g
UREA
36 g
AGUA
84.4 ml
TBE 10%
10 ml
100 ml
Para la preparación del gel de secuencia desgasificar 60 ml de solución madre, posteriormente agregar 50l de TEMED (4 oC). y300 l de Persulfato de Amonio (10%), depositar esta solución entre las placas de vidrio (utilizando una jeringa), una vez depositado el gel entre los vidrios colocar en la parte superior la peineta...
GELES DE AGAROSA:
Para separar fragmentos de ADN de mayor tamaño (entre 0,5 y 30 Kb) se utiliza electroforesis en geles de agarosa de concentración variable 0.7 - 2.5%, en solución TAE 1X(Tris-HCl 40 mM, EDTA 2 mM, Acido Acético Glacial, pH 8,0). Los geles analíticos se realizan en forma horizontal, quedando estos sumergidos, es decir, cubiertos al menos por 2 mm de solución amortiguadora deelectroforesis (TAE 1X).
Los geles se corren a 100 volt hasta la salida de la muestra del pocillo e ingreso de esta al gel, y 70 volt. para su desplazamiento a través de este. Usando TAE 1X comoamortiguador de corrida. Las muestras son cargadas en volúmenes de 6 l más 2 l de loading buffer ( Glicerol 25%, Azul de Bromofenol 0,025% y EDTA 12 mM).
El ADN se observa posteriormente en untrans-iluminador UV, luego de haber incubado el gel durante 15 minutos en una solución de Bromuro de Etidio 0,5 g/ml.
GELES DE POLIACRILAMIDA:
Para separar los fragmentos de ADN de menortamaño, se usan geles de poliacrilamida desde 5% al 10% (dependiendo del tamaño de fragmentos estudiados). La solución madre contiene 30% de acrilamida y 1% de Bis-acrilamida.
Para la preparación100 ml de solución madre (10%) se agrega Acrilamida / Bis-Acrilamida (30:1), 10 ml de TBE 10X (Tris-HCl 0,9 M pH 8,0 ; Acido Bórico 0,9 M y EDTA 20 mM pH 8,0); 36 gr de Urea y 84,4 ml de aguabidestilada. Una vez disuelto todos los componentes se procede a filtrar la solución (utilizar papel filtro de 0.2 m) posteriormente almacenar a 4 oC.
POLIACRILAMIDA 10% (100 ml)
ACRILAMIDA
9.678 gBIS-ACRILAMIDA
0.322 g
UREA
36 g
AGUA
84.4 ml
TBE 10%
10 ml
100 ml
Para la preparación del gel de secuencia desgasificar 60 ml de solución madre, posteriormente agregar 50l de TEMED (4 oC). y300 l de Persulfato de Amonio (10%), depositar esta solución entre las placas de vidrio (utilizando una jeringa), una vez depositado el gel entre los vidrios colocar en la parte superior la peineta...
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