Proceso Analítico “Validación De Un Método Para La Determinación De Ácido Benzoicoen Productos Lácteos”

INTRODUCCIÓN
El avance tecnológico ha permitido incrementar la vida en anaquel de los alimentos lácteos, utilizando tratamientos químicos como agentes conservadores.
Los conservadores empleados en productos lácteos son: formaldehído, agua oxigenada, ácido salicílico, ácido benzoico, ácido paraoxibenzoico y ácido bórico. De éstos, el más utilizado es el ácido benzoico (AB)
Las legislacionesvigentes autorizan el empleo de AB en bebidas refrescantes, conservas de frutas y vegetales, jugos de frutas, galletas, productos de confitería y productos lácteos, pero prohíben su adición en leche fresca. Se permite su uso en un intervalo de concentración de 0.05 a 0.1% en peso como benzoato de sodio. Este porcentaje está basado en la RfD para la población adulta, mas no para la poblacióninfantil.
El AB es considerado como una sustancia GRAS (generalmente reconocida como segura), ya que no causa problemas de toxicidad en el hombre cuando se ingiere en las concentraciones normales. Sin embargo, la literatura reporta que a concentraciones elevadas (100 veces más la RfD) puede causar irritación del tracto digestivo y en situaciones extremas convulsiones epileptiformes. Por otro lado, noexisten estudios de riesgo carcinogénico por exposición oral.
Diferentes métodos han sido desarrollados para la determinación de AB en alimentos, entre los que se encuentran la Cromatografía en Capa Fina (CCF), la Espectrofotometría Ultravioleta (UV), la Cromatografía de Gases (CG) y la Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución (CLAR). De estos métodos, la CLAR es la técnica más utilizada para ladeterminación de AB en diferentes alimentos y otros productos.







Métodos
Estándares y solventes
Estándar de AB grado analítico marca Fisher (99.9% de pureza). Los solventes agua, metanol (MeOH) y acetonitrilo (AcCN) fueron grado HPLC marca Fisher. Se prepararon las siguientes soluciones a partir de reactivos obtenidos todos de los laboratorios Merck: HC2H3O2 (HAcO) 1M a pH de 4.5y 4.2, H2SO4 al 10% (v/v), K4Fe(CN)6 al 15 %, Zn(C2H3O2)2 al 30%, HCl al 50% (v/v), NaOH 0.1 M
Condiciones Cromatografías
Para llevar a cabo la determinación de AB en los productos lácteos se procedió previamente a desarrollar y validar un método analítico. Para establecer las condiciones de análisis cromatográfico se trabajó con el estándar de 60 mg/L, empleando un diseño factorial en donde semantuvo constante la fase estacionaria y la longitud de onda de detección a 230 nm.
Las variaciones se realizaron en la composición de la fase móvil y la velocidad de flujo. Las fases móviles que se probaron fueron las siguientes:
a) HAcO 1 M a pH de 4.2-MeOH 60:40
b) HAcO 1 M a pH de 4.5-AcCN 80:20
c) Buffer de fosfatos 0.05 M a pH de 2.3-AcCN 60:40.
Igualmente se probaron tresvelocidades de flujo a 1.0, 1.3, y 1.5 mL/min. Las mejores condiciones cromatográficas se seleccionaron en base al Número de platos teóricos (N), al factor de capacidad (k´) y al factor de asimetría (FA); los cuales fueron calculados a partir de los picos cromatográficos.
• Tratamiento Previo de la muestra y extracción en fase sólida
Las muestras fueron sometidas a dos etapas de procesamiento: la primerade tratamiento previo y la segunda de extracción en fase sólida, empleando cartuchos Sep-Pack C18. Dos métodos de tratamiento previo de la muestra fueron probados, el método de desproteinización ácida y el método de ultrasonido.



Método de ultrasonido
Una muestra de 20 mL o 20 g se mezcló con 25 mL de NaOH 0.1 M y se sometió a ultrasonido por 15 minutos, se ajustó a un pH de 8 con HCl al50%, para posteriormente someterla a desproteinización con 2 mL de ferrocianuro de potasio al 15% y 2 mL de acetato de zinc al 30%, enseguida se filtró al vacío, el filtrado se llevó a pH de 1 y de 3 con HCl al 50% y finalmente se aforó a 50 mL con agua grado HPLC.
Método de desproteinización ácida
Una muestra de 100 mL o 100 g se sometió a reflujo por 30 minutos con 15 mL de H2SO4 al 10%, 10...