Protocolo De Cultivo De Células De Insecto

PROTOCOLO DE CULTIVO DE CÉLULAS DE INSECTO

INTRODUCCIÓN
Las células transgénicas de insectos son células modificadas genéticamente para producir proteínas recombinantes, las cuales son similares a proteína encontradas en el sistema de los mamíferos. Para llevar a cabo esta modificación genéticamente se utiliza como herramienta de investigación el sistema del vector de expresión delbaculovirus (BEVS- “Baculovirus Expresión Vector System”), comúnmente se encuentran en los vegetales verdes y por lo tanto forman parte de una dieta saludable de todos los individuos (Palomares et al.; 2007)
El protocolo de cultivo de células de insecto, consiste en la manutención de líneas celulares de insecto en condiciones controladas de laboratorio. Se trata de un cultivo celular especial, cuyaprincipal aplicación consiste en el cultivo de baculovirus de cara a la expresión y purificación de proteína recombinante.
Utilizando dos líneas celulares:
* Sf9: deriva de las células IPLB-Sf21-AE de Spodoptera frugiperda. Las células Sf9 se adaptan al cultivo en suspensión en medio X‐press para la expresión transitoria o mantenida de proteína recombinante. Su tiempo de duplicación es de 18-30h. hasta una densidad máxima de 8-12 × 106 células/ml. Se mantienen en cultivo en suspensión para la propagación de baculovirus y producción de proteínas recombinantes o cultivo en monocapa para cotransfección o ensayos en placa para la purificación de baculovirus recombinantes. Pueden ser criopreservadas (Peña et al.; 2010)
* Tni: las células High Five (BTI-TN-5B1-4) derivan de la líneacelular de Trichopulsia ni. Estas células son utilizadas para la obtención de proteínas recombinantes cuando se usa el sistema de expresión basado en baculovirus. Además, al igual que las Sf9, pueden crecer en medio X‐press en cultivos en monocapa, y menos eficientemente en suspensión (Miranda et al.; 2007)
* UFL-AG-286: las células son mantenidas en forma de cultivos adherentes en frascosplasticos de 25cm² de superficie, en medio de cultivo TC-100 (Invitrogren, USA), suplementado con 10% de suero fetal bovino (Bioser, República Argentina), 27°C de temperatura. Los cultivos se replicaron en medio fresco, a una dilución 1:10, cada cuatro a cinco días (Gioria et al.; 2006)
El sistema de expresión del Baculovirus es usado para expresar genes heterólogos en células y larvas de insectos.Los baculovirus son un tipo de virus que infectan artrópodos, especialmente insectos. Durante su infección, las partículas virásicas se empaquetan en unos grupos llamados cuerpos poliédricos. La tecnología de ensamblaje llamado Sistema de Expresión de Baculovirus (BEVS) es una producción rápida de proteínas recombinantes en células de insectos.
1. Se inserta el ADN heterólogo en un vectorintermedio llamado de transferencia, que no posee capacidad infectiva, es un vector con secuencias de E. coli (para hacer las manipulaciones fácilmente en la bacteria), y que lleva el promotor de la poliedrina, al cual se inserta el gen de interés.
2. Se co-transfectan células de insecto con el vector que lleva el ADN clonado y con ADN virásico no recombinante.
3. La recombinación in vivo entre elvector de transferencia y secuencias del genoma virásico, con lo que se generan genomas recombinantes que se pueden seleccionar y usar para producir la proteína de interés.
Estas técnicas han sido utilizadas en diferentes experimentos de los cuales se puede encontrar un trabajo basado en la técnica de Baculovirus, en donde se reporto la clonación y expresión , de una cisteín-proteasa (CP), delparásito gastroentérico de rumiantes Haemonchus contortus, con el objetivo de obtener con fines inmunodiagnósticos una proteasa recombinante con propiedades bioquímicas e inmunogénicas semejantes a las naturales aplicable a las campañas de diagnóstico, prevención y control de la hemoncosis ovina. La CP se identificó como un precursor inactivo fusionado con un sitio de afinidad 6XHis y se aisló por...