Protocolo de extracción de ADN
Páginas: 2 (283 palabras)
Publicado: 16 de junio de 2014
PROTOCOLO DE EXTRACCIÓN BASADO EN EL MÉTODO Triton X- 100 (1%) and dithiothreitol TD (Oskam et al., 1996)
1. Primero colocamos grupos de 20 especimenes (todo el cuerpo) porespecie en tubos eppendorf de 1.5 ml debidamente rotulados (código del vial de cada especie), a los que agregamos 500 ml de Buffer de Lysis (50 mM NaCl, 10 mM EDTA pH 8.0, 50 mMTris- HCl pH 7.4) que contenía además 1% de Triton X- 100, 10 mM DTT y dos bolitas de cerámica. Los viales eran colocados en una centrifuga (nombre tipo) por espacio de 45 segundos amediana velocidad (maceración).
2. Luego los tubos se amarraban con hilo por las tapas, a razón de 6 tubos por cuerda, a manera de cuentas de un rosario (fig. __) y, se pasaban porcuatro (4) ciclos de 15 segundos en nitrógeno líquido y 1:30 minutos en baño húmedo a 60 °C respectivamente.
3. Posteriormente colocamos los tubos en incubación a 60 °C por una(1) hora.
4. Luego el sobrenadante era traspasado a nuevos tubos de eppendorf de 1.5 ml, también rotulados, conteniendo 1000 ml de Buffer de Lysis (50 mM NaCl, 10 mM EDTA pH 8.0,50 mM Tris- HCl pH 7.4) Proteinasa K y 1% de Triton X- 100 a razón de 200 mg/ml y dejados en incubación a 60 °C por tres (3) hora.
5. Posteriormente los tubos eran colocados enuna centrifuga a 13,200 Rpm por espacio de diez (10) minutos y sacados cuidadosamente evitando que el material se mezclará, el sobrenadante era trasvasado a nuevos tubos eppendorf1.5 ml con la ayuda de pipetas de vidrio desechables.
6. Finalmente la muestra podía guardarse a –20 °C para usarse el día siguiente o diluir el material de cada tubo en unaalícuota de 1:10 en agua Sigma y luego colocarlos en agua hirviendo por 10 minutos y con esto completar la solución de trabajo para la prueba de PCR en la cantidad requerida.
1. Primero colocamos grupos de 20 especimenes (todo el cuerpo) porespecie en tubos eppendorf de 1.5 ml debidamente rotulados (código del vial de cada especie), a los que agregamos 500 ml de Buffer de Lysis (50 mM NaCl, 10 mM EDTA pH 8.0, 50 mMTris- HCl pH 7.4) que contenía además 1% de Triton X- 100, 10 mM DTT y dos bolitas de cerámica. Los viales eran colocados en una centrifuga (nombre tipo) por espacio de 45 segundos amediana velocidad (maceración).
2. Luego los tubos se amarraban con hilo por las tapas, a razón de 6 tubos por cuerda, a manera de cuentas de un rosario (fig. __) y, se pasaban porcuatro (4) ciclos de 15 segundos en nitrógeno líquido y 1:30 minutos en baño húmedo a 60 °C respectivamente.
3. Posteriormente colocamos los tubos en incubación a 60 °C por una(1) hora.
4. Luego el sobrenadante era traspasado a nuevos tubos de eppendorf de 1.5 ml, también rotulados, conteniendo 1000 ml de Buffer de Lysis (50 mM NaCl, 10 mM EDTA pH 8.0,50 mM Tris- HCl pH 7.4) Proteinasa K y 1% de Triton X- 100 a razón de 200 mg/ml y dejados en incubación a 60 °C por tres (3) hora.
5. Posteriormente los tubos eran colocados enuna centrifuga a 13,200 Rpm por espacio de diez (10) minutos y sacados cuidadosamente evitando que el material se mezclará, el sobrenadante era trasvasado a nuevos tubos eppendorf1.5 ml con la ayuda de pipetas de vidrio desechables.
6. Finalmente la muestra podía guardarse a –20 °C para usarse el día siguiente o diluir el material de cada tubo en unaalícuota de 1:10 en agua Sigma y luego colocarlos en agua hirviendo por 10 minutos y con esto completar la solución de trabajo para la prueba de PCR en la cantidad requerida.
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