Protocolo de extraccion de adn

EXTRACCIÓN DE ADN A PARTIR DE SANGRE TOTAL MEDIANTE EL METODO DE FENOL CLOROFORMO.
En frascos ámbar estériles se prepara.
Lisis Rojos Cloroformo Isoamílico: 24 partes Cloroformos 1 Parte deAlcohol Isoamílico

40 mL Tris HCL 1M pH 8.0
5mL MgCl2 1M
2mL NaCl 5M
Ajustar a 500mL

FENOL Líquido + Buffer de 10,5 pH (7,2 a 7,8)
Buffer comercial de 10,5
Lisis Blancos

10mL TrisHCL 1M pH 8.0
20mL EDTA 0,5 M pH 8.0
2mL NaCl 5M
Ajustar a 500mL

Si se parte de 1mL de Sangre

1. En un tubo falcon de 15 mL agregar 1mL de sangre y 2mL de solución de lisis rojos,mezclando cuidadosamente.
2. Incubar a temperatura ambiente durante 5
3. minutos.
4. Centrifugar a 3500 rpm durante 7 minutos.
5. Descartar el sobrenadante cuidando el pellet.
6.Adicionar 3 mL de solución de lisis rojos.
7. Centrifugar a 3500 rpm durante 7 minutos. Descartar sobrenadante.
8. Repetir los pasos 5, 6 y 7 (MÁXIMO 3 LAVADOS).
9. Adicionar al pellet 1mLde solución de lisis Blancos y 6 µl de proteinasa K.
10. Dar vortex suavemente.
11. Adicionar 100 µl de SDS al 10%.
12. Incubar toda la noche a 56ºC, teniendo en cuidado cada 3 o 4 horasde deshacer el pellet (mínimo 6 horas).
13. Adicionar Fenol frio a 4ºC y pH de 7,2 hasta 2 mL y ajustar a pH de 7,8 con HCL (si es necesario) y mezclar cuidadosamente durante 5 minutos paraprecipitar proteínas.
14. Centrifugar a 3500 rpm durante 7 minutos.
15. Trasvasar el sobrenadante a un tubo nuevo.
16. Adicionar al sobrenadante 500µL de fenol cloroformo y 500µL de cloroformoisoamílico frio a -20ºC. Mezclar cuidadosamente durante 5 minutos para precipitar proteínas.
17. Centrifugar a 3500 rpm durante 7 minutos.
18. Pasar sobrenadante a tubo nuevo.
19. Adicionar3 volúmenes de cloroformo isoamílico, mezclar cuidadosamente durante 5 minutos para precipitar proteínas se debe observar una solución lechosa.
20. Centrifugar a 3500 rpm durante 7 minutos....
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