Protocolo Para el aislamiento de proteinas
Páginas: 2 (331 palabras)
Publicado: 9 de julio de 2015
Protocolo
1. Se usará docena y media de huevos no fertilizados para obtener aislamiento de proteinas.
Se vavían los huevos y los cascarones se los laba con agua corriente.
2. La separaciónde las membranas se las hace después de el tratamiento por media hora con ácido etilendiaminotetraacético, Aldrich al 5% en una temperatura de 4 C. Mediante este tratamiento se puede separarla cutícula, lavando el cascarón con abundante agua corriente y posteriormete con agua destilada.
3. Los cascaron labados se los secará a temperatura ambiente sobre papel absorbente.
4. En elmortero se procederá a molerlos hasta que las partículas sean lo más pequeñas posible.
5. Una vez que se tiene pulverizado los cascarones con un peso aproximado de 50-65 gramos, con ácidoacético al 20% se lo agita constantemente (10 ml por gramo de cascarón) a una temperatura de 4 C.
6. La sustancia se centrifugará a 22.100 x g durante 1.5 horas.
7. se recolectará el sobrenadantey se dializará contra 5x10 vol. De ácido acético al 5%, que contenía 5 nM de EDTA Y 0.025% de NaN3 para cada cambio en la diálisis.
8. Para poder precipitar a la fase proteica, la solucióndializada se llevará a la saturación con sulfato de amonio durante 24 horas.
9. Esta solución se la sentrifugará a 64.500 x g durante 50 minutos a 4 C.
10. El sobrenadante se descartará y elbotón será resusendido y dializado contra ácido acético al 10% para removerl el sulfato de amonio.
11. La solución resultante fue centrifugada a 29.500 x g por un lapso de 5 minutos y elsobrenadante fue filtrad con filtros de polifluoruro de vinilideno (PVDF) con abertura de malla de 0.2 um.
12. la solución que contenía la porción soluble intramineral del cascarón de huevo fueinyectada a una columca Vydan C4 de HPLC fase reversa (50 x 4.6 mm), usando como fase móvil 100% de acetonitrilo más 0.1% de TFA (ácido trifluoroacético) y utilizando diferentes gradientes.
1. Se usará docena y media de huevos no fertilizados para obtener aislamiento de proteinas.
Se vavían los huevos y los cascarones se los laba con agua corriente.
2. La separaciónde las membranas se las hace después de el tratamiento por media hora con ácido etilendiaminotetraacético, Aldrich al 5% en una temperatura de 4 C. Mediante este tratamiento se puede separarla cutícula, lavando el cascarón con abundante agua corriente y posteriormete con agua destilada.
3. Los cascaron labados se los secará a temperatura ambiente sobre papel absorbente.
4. En elmortero se procederá a molerlos hasta que las partículas sean lo más pequeñas posible.
5. Una vez que se tiene pulverizado los cascarones con un peso aproximado de 50-65 gramos, con ácidoacético al 20% se lo agita constantemente (10 ml por gramo de cascarón) a una temperatura de 4 C.
6. La sustancia se centrifugará a 22.100 x g durante 1.5 horas.
7. se recolectará el sobrenadantey se dializará contra 5x10 vol. De ácido acético al 5%, que contenía 5 nM de EDTA Y 0.025% de NaN3 para cada cambio en la diálisis.
8. Para poder precipitar a la fase proteica, la solucióndializada se llevará a la saturación con sulfato de amonio durante 24 horas.
9. Esta solución se la sentrifugará a 64.500 x g durante 50 minutos a 4 C.
10. El sobrenadante se descartará y elbotón será resusendido y dializado contra ácido acético al 10% para removerl el sulfato de amonio.
11. La solución resultante fue centrifugada a 29.500 x g por un lapso de 5 minutos y elsobrenadante fue filtrad con filtros de polifluoruro de vinilideno (PVDF) con abertura de malla de 0.2 um.
12. la solución que contenía la porción soluble intramineral del cascarón de huevo fueinyectada a una columca Vydan C4 de HPLC fase reversa (50 x 4.6 mm), usando como fase móvil 100% de acetonitrilo más 0.1% de TFA (ácido trifluoroacético) y utilizando diferentes gradientes.
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