Protocolos en el laboratorio

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ANEXO A: DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES USANDO EL MÉTODO DEL ÁCIDO 3, 5 – DINITROSALICÍLICO

El método se basa en la oxidación del grupo aldehído o cetona presente en el azúcar y la respectiva reducción del DNS a ácido 3-amino-5-nitrosalisílico. Esta reacción produce un complejo coloreado que presenta la mayor actividad óptica en una longitud de onda de 540 nm, lo cual permite realizaruna gráfica a diferentes concentraciones de una solución patrón de glucosa, para luego identificar la cantidad de azúcares reductores presentes en una muestra.

Pasos para preparar DNS (Ácido 3-5 dinitrosalicílico)

• Disolver 1,6 g de NaOH en agua destilada
• Adicionar 30 g de tartrato de Na y K
• Adicionar 1 g de DNS
• Aforar a 100ml con agua destilada.
• Almacenar en frascos ámbar a 4°CPasos para preparar la curva estándar

• Pesar 0,2 g de glucosa, diluir con agua destilada y llevar a un balón volumétrico de 50 mL
• Tomar 7 tubos de ensayo y depositar en cada uno de ellos las cantidades de solución de glucosa preparada y agua que se observan en la tabla A.1.
• Tomar 0,5ml de cada disolución estándar y agregar 0.5ml de reactivo DNS
• Realizar mediciones a 540 nm yconstruir la curva.

Tabla A.1. Concentraciones de glucosa para la elaboración de la curva patrón

|Concentración (g/L) |0,2 |0,4 |0,6 |0,8 |1,0 |1,2 |
|Glucosa (mL) |0,025 |0,050 |0,075 |0,100 |0,125 |0,150 |
|H2O (mL) |0,475|0,450 |0,425 |0,400 |0,375 |0,350 |
|Volumen Total (mL) |0,500 |0,500 |0,500 |0,500 |0,500 |0,500 |

Tratamiento de las muestras
• Ajustar las muestras a un pH neutro.
• Tomar 0.5ml de cada muestra al 20% y agregar 0,5ml de reactivo de DNS.
• Preparar un blanco pordilución con agua destilada y 0,5ml de reactivo de DNS.
• Agitar todas las muestras.
• Colocar a ebullir las muestras en baño de María por 5 min.
• Enfriar con hielo.
• Adicionar 5ml de agua destilada.
• Agitar y dejar en reposo por 15 min.
• Leer a 540Nm en el espectrofotómetro.
ANEXO B: DETERMINACIÓN DE CONCENTRACIÓN DE XILOSA USANDO EN KIT ENZIMATICO MEGAZYME INT IRELAND LIMITED

Lainterconversión de las formas anoméricas α y β de D-Xilosa es catalizada por la xilosa mutarotasa (XMR) (1).

(1) α-D-Xilosa β-D-Xilosa

La D-xilosa es oxidada por NAD+ a ácido D-xilónico en la presencia de β-Xilosa deshidrogenasa (β-XDH) a pH 7,5 (2).

(2) β-D-Xilosa + NAD+ D-ácido xilónico + NADH + H+

La cantidad de NADH formado es esta reacción esestequiométricamente equivalente con la cantidad de D-Xilosa. Es el NADH el que es medido por el incremento en la absorbancia a
340 nm.

El procedimiento para la lectura de las muestras es el siguiente:
• Se diluye la muestra de fermentación (sobrenadante de la centrifugación) 1:100.

[pic]

|Pipetear en tubos |Blanco|Muestra |
|Agua destilada (25°C) |2.10 ml |2.00 ml |
|Muestra |- |0.1 ml |
|Solucion 1 (mezcla Buffer TEA/MgCl2 |0.4 ml|0.4 ml |
|Solucion (NAD*/ ATP) |0.4 ml |0.4 ml |
|Suspensión 3(hexoquinasa) |0.02 |0.02 |

• Se debe mezclar la solución preparada y leer la absorbancia (A1) de la solución, luego de 5 min....
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