prueba de reductasa

PRACTICA N°8
PRUEBA DE REDUCTASA

I. CAPACIDADES
Identificar la importancia de la prueba de la reductasa en la leche.
Determinar la prueba de la reductasa en muestras de leche.

II. FUNDAMENTO TEORICO
Esta prueba ha sido mal llamada “reductasa" cuando realmente esta enzima no interviene en ella. El verdadero principio es el siguiente: el potencial de óxido-reducción (Eh) de la lechefresca aireada es de +0,35 a +0,40 voltios (350 a 450 milivoltios), el cual se debe principalmente al contenido de oxígeno disuelto en el producto. Si por cualquier causa ese oxígeno es separado, el Eh disminuye. Esto ocurre cuando los microorganismos crecen en la leche y consumen el oxígeno. Si el número de microorganismo es muy elevado, el consumo de oxígeno será mayor y por consiguiente el Ehcaerá rápidamente; si por el contrario, el número de microorganismos es pequeño, el Eh disminuirá lentamente. 

El principio de este método encuentra aplicación en la determinación de la calidad sanitaria de la leche, utilizando como indicador de óxido-reducción al azul de metileno (APHA, 1972) este se presenta de color azul en su forma oxidada y es incoloro en su forma reducida. En solución acuosade pH 7,0 su oxidación es completa a Eh +0,075 voltios y su reducción es completa a Eh – 0,015 voltios.
En la leche, por existir un pH menor de 7 (6.5 - 6.7), la reducción completa del azul de metileno ocurre a un Eh más positivo, habiéndose demostrado que esto tiene lugar a un Eh entre +0,075 a +0,225. El tiempo en  horas que tarda en pasar el azul de metileno de su forma oxidada (azul) a lareducida (incolora) bajo condiciones controladas es proporcional a la calidad sanitaria de la leche y aunque no es posible establecer con exactitud el número de microorganismos, es factible clasificar el producto dentro de ciertos grados aceptables o no aceptables, en base a los siguientes valores:

Debe tenerse presente que la anterior clasificación no siempre es apropiada ya que existen otrosfactores que pueden afectar al tiempo de reducción, entre ellos, el tipo de microorganismo, el número de leucocitos, el periodo de exposición a la luz, la cantidad de oxígeno disuelto y la tendencia de la leche a elevar los microorganismos hacia la superficie a medida que se va separando la crema en el tubo de prueba. Es así como ciertos microorganismos son más activos en su capacidad reductora queotros, mientras que existen algunas especies que son muy poco activas en este sentido Por otra parte, a medida que aumenta el número de leucocitos en la leche y su exposición a la luz natural o artificial, el tiempo de reducción tiende a reducirse, mientras que la agitación (al aumentar la cantidad de oxígeno disuelto) y la tendencia de la crema a ascender (arrastrando los microorganismos) sonfactores que tienden a retardar el tiempo de reducción.

Para los efectos de compra-venta se podrá utilizar el TRAM de acuerdo a lo siguiente:
* Clase I: leche fría con más de 4 horas de TRAM
* Clase II: leche fría con 2 a 4 horas de TRAM
* Clase III: leche caliente con 30 min a 2 horas de TRAM



III. MATERIALES

Leche
Pipeta estériles
Tubos de ensayos limpios y esterilizados
Solución deazul de metileno
Baño de maria

IV. PROCEDIMIENTO

Con una pipeta estéril, colocar 10ml de leche y con otra pipeta 1ml de solución de azul de metileno en un tubo de ensayos.
Mezclar bien y poner a incubar en baño maria a 37°C
Tomar el tiempo cada media hora, hasta que la muestra se torne blanca.
Lectura
Cuadro N°16 escala de tiempo de reducción de azul de metileno indicadora a la calidadde la leche.
TIEMPO
CALIDAD DE LA LECHE
Menos de una hora
Entre una y tres horas
Entre tres y cinco horas
Más de cinco horas
Mala
Regular
Buena
Excelente

También existe una prueba de microscópico, que consiste en esparcir en un porta objeto 3ª 5 gotas de leche y agregar 1 a 2 gotas de H2O2. Si aparecen en la lámina contra fondo oscuro pequeñas burbujas,...