pruebas bioquimicas

COAGULASA
La coagulasa es una proteína de composición química desconocida con actividad semejante a la protrombina capaz de convertir el fibrinógeno en fibrina produciendo un coágulo visible en un ambiente apropiado. Se cree que la coagulasa actúa in vivo formando una barrera de fibrina en el sitio de la infección estafilocócica. Esto tal vez desempeñe un papel en la localización de losmicroorganismos en abscesos. En el laboratorio la prueba que se utiliza para diferenciar a Staphylococcus aureus de los otros estafilococos y micrococos.
La coagulasa está en dos formas: libre y ligada. La ligada (portaobjetos) está unida a la pared de la célula bacteriana y no se encuentra presente en los filtrados de los cultivos. Las hebras de fibrina se forman entre las células bacterianassuspendidas en plasma, haciendo que se agrupen en agregados visibles cuando se observan en la prueba de portaobjeto, la coagulasa ligada (tubo) es una sustancia semejante a la trombina presente en los filtrados de los cultivos. Cuando una suspensión de bacterias se mezcla con una misma cantidad de plasma en tubo de prueba se forma un coágulo visible como resultado de la utilización de los factoresplasmáticos de coagulación.

Prueba en portaobjeto:
Se coloca una gota de agua destilada estéril o solución salina sobre un portaobjetos.
Se emulsifica una suspensión del mo a estudiar en la gota de agua
Se coloca una gota de plasma coagulasa reconstituido y se mezcla
Se mueve el portaobjetos hacia delante y atrás y se observa la precipitación

Prueba en Tubo.-
En forma aséptica se colocan 0.5 mlde plasma de conejo reconstituido en el fondo de un tubo de prueba estéril
Se agregan 0.5 ml de caldo de cultivo puro de 18 – 24 h del mo en estudio
Se mezcla con suavidad rotando el tubo con el propósito de no revolver o sacudir la mezcla
Se coloca el tubo en un baño de agua. Se observa la formación de un coágulo visible.

PRUEBA DE HIDROLISIS DEL HIPURATO

OBJETIVO:
Diferenciar a losestreptococos (-hemoliticos que contienen la enzima hipuricasa, de los estreptococos (-hemoliticos que no la contienen.


FUNDAMENTO:
La producción de hipuricasa por los estreptococos del grupo b resulta de la hidrólisis del hipurato de sodio con la formación de benzoato de sodio y glicina. La hidrólisis del ácido hipurico se detecta por medio de dos métodos:

1.- prueba estándar delbenzoato usando cloruro férrico al 7 %. El cloruro férrico precipita proteínas, el hipurato y el benzoato; sin embargo las proteínas y el hipurato son más solubles que el benzoato en exceso de cloruro férrico. Así la presencia de un precipitado en el caldo de cultivo después de agregar cloruro férrico en exceso indicando la presencia de benzoato y una reacción positiva para la hidrólisis dehipurato.

2.- prueba rápida para glicina usando reactivo de ninhidrina: la ninhidrina es un fuerte agente oxidante que deamina los grupos (-aminos con la liberación de amonio y bióxido de carbono. El amoniaco liberado reacciona con la ninhidrina residual y produce un color púrpura. El único grupo amino formado de la hidrólisis del hipurato es el de la glicina. Esta prueba se realiza de 2 a 3horas de incubación.

MEDIOS Y REACTIVOS.
PRUEBA DE BENZOATO MEDIO HIPURATO DE SODIO.

Caldo infusión de corazón
25 g

Hipurato de sodio
10 g

Agua destilada
1000 ml

REACTIVO DE CLORURO FERRICO

FeCl3 6H2O
12 g

2% HCl acuoso
100 ml

PRUEBA DE LA GLICINA REACTIVO DE HIPURATO DE SODIO

hipurato de sodio
1 g

Agua estilada
100 mlREACTIVO DE NINHIDRINA

Ninhidrina
3.5 g

1:1 acetona/butanol
100 ml


PROCEDIMIENTO:
? PRUEBA DEL BENZOATO
1.
1)inocular el tubo con medio de hipurato de sodio con el microorganismo en estudio
2)incubar a 35ºC durante 20 horas ó más. 3)Centrifugar el medio para compactar las células 4)Pipetiar 0.8 ml del sobrenadante en un tubo limpio. 5) Agregar 0.2 ml del reactivo de cloruro...