purificación de rna viral

Introducción:
La extracción y purificación de los ácidos nucléicos es la primera etapa para la mayoría de los estudios de biología y diagnóstico molecular. Los métodos de extracción son los que nos permiten obtener ácidos nucleicos de diversas fuentes para posteriormente realizar un análisis específico ya sea con una PCR o con una electrofroresis.
La calidad y la pureza de los ácidosnucléicos son 2 características muy importantes ya que si se desea obtener una muestra libre de contaminantes se debe aplicar un protocolo de extracción adecuado.En cuanto a la extracción esta se puede realizar mediante diferentes procedimientos como el uso de detergentes, el uso de calor, choque osmótico, ciclos de congelación-descongelación, enzimas como la lisozima, sonicación, etc. Posteriormente serealiza la purificación, algunos métodos empleados son: extracción/precipitación, cromatografía, separación por afinidad entre otros.
Ya realizada la purificación esta se puede ser analizada utilizando un espectofotómetro para medir su absorbancia o realizando una cuantificación con una PCR en tiempo real. También se puede realizar una electroforesis en gel de poliacrilamida esta se fundamentaen la separación electroforética de los segmentos del DNA o RNA.

Toda esta técnica se podría utilizar como diagnóstico, en este caso para rotavirus, virus que afecta a niños pequeños con diarreas severas. Hasta hace algunos años no existía una técnica para un diagnóstico efectivo por lo que se intentó realizar una PAGE, ya que esta no requiere de equipos sofisticados y es más económica queotras pruebas (ELISA, MET).

La “rotaforesis” resulta conveniente ya que es una prueba muy sensible y tiene mucha especificidad, también tiene como ventaja que se pueden analizar muchas muestras simultáneamente y puede proveer información epidemiológica de los diferentes tipos de cepas de rotavirus existentes. Su única desventaja podría ser que los resultados se obtienen en un lapso muy largo detiempo (tiempos totales de hasta 14 horas) pero se han podido ir acortando utilizando cámaras de electroforesis más pequeñas dismuniyendo así el tiempo de corrida electroforéctica. Por todo esto esta prueba resulta una excelente opción para laboratiorios con recursos insuficientes para adquisición de kits comerciales de ELISA y que es un método sensible y económico.

El objetivo de esta prácticaes poder realizar una correcta purificación para posteriormente visualizarlo en un PAGE e identificar la presencia de rotavirus y la existencia o no de diferentes cepas.












Materiales & Métodos
Purificación
Suspensión de heces fecales al 20% en buffer PBS (200 µl de heces+ 800 µl de buffer PBS)
200 µl Buffer de lisis (SDS + β-mercapto etanol)
200 µl de fenol (agentedesnaturalizante de proteínas)
200 µl de cloroformo (Agente que elimina las proteínas en el medio y el fenol)
1ml de etanol absoluto
Agua nano pura libre de sales
PAGE
2 ml de acrilamida-bisacrilamida al 30%
1.02 ml de Tris-HCI 2 M pH 8.8
2.98 mL de Agua Bidestilada
100 µl de persulfato de amonio
10 µl de TEMED
Tinción
50ml de solución fijadora (etanol al 10% + ácido acético al 0.5%)
50mL de nitrato de plata
Agua Bidestilada
50mL de solución reveladora (NaOh al 10M y Formaldehído)
50mL de solución de ácido acético
Pasos a seguir:
Extracción y Purificación de RNA Viral
1. Realizar una suspensión de heces fecales al 20% en un buffer de PBS
2. Mezclar por 2 minutos en el vórtex para liberar al virus
3. Centrifugar los tubos a 14000 rpm por cinco minutos ( Debenaparecer 2 fases, la de más abajo las heces y la superior el sobrenadante)
4. Tomar 200 µl del sobrenadante y depositarlo en un nuevo tubo de 1.5ml
5. Adicionar 200 µl de buffer de lisis (este rompe y desnaturaliza las proteínas y libera el RNA)
6. Agitar por 2 minutos en el vórtex (fin de la etapa de extracción)
7. Adicionar 200 µl de fenol para desnaturalizar proteínas y agitar en el vortex...