Purificación de enzimas

PURIFICACIÓN DE ENZIMAS:
Aislamiento y purificación de Lisozima.

(Bacteriólogo británico Alexander Fleming, descubrió la lisozima, 1920)





Índice:
-Portada……………………………………………………………………………………………………………………………………………………….……..1

-Índice………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….…….2

-Introducción……………………………………………………………………………………………………………………………..…………….………3-Introducción…………………………………………………………………………………………………………………….……...3
-Objetivo……………………………………………………………………………………………………………………………….……3

-Materiales y métodos……………………………………………………………………………………………………………………………..…..…4
-Materiales…….…………………………………………………………………………………………………………………………..3
-Métodos………………………………………………………………………………………………………………………………..….3
- Esquema del proceso de purificación…………………………………………………………..…..……………….4

-Resultados………………………………………………………………………………………………………………………………………………….…….7

-Discusión y Conclusiones……………………………………………………………………………………………………………….……………….8

-Bibliografía……………………………………………………………………………………………………………………………………………….………8

Introducción:
La lisozima es una enzima que destruye las paredes celulares bacterianas mediante la hidrólisis de los enlacesglucosídicos β(1→4) del ácido N-acetilmurámico(NAM) a N-acetilglucosamina (NAG) en el componente polisacárido NAM-NAG alternante de los peptidoglucanos de la pared celular.
Posee una amplia distribución en las células y las secreciones de los vertebrados (donde puede actuar como un agente bactericida), invertebrados, plantas, bacterias y virus.
La lisozima de clara de huevo de gallina (CHG) es la que seha estudiado con más profundidad y en la que mejor se conoce su mecanismo de acción. Es una proteína bastante pequeña (14,7 kDa) cuya cadena polipeptídica presenta 129 residuos de aminoácidos y tiene cuatro enlaces cruzados internos de disulfuro.
En el centro catalítico de la CHG encontramos dos aminoácidos ácidos, Glu35 y Asp52; estos se encuentran a ambos lados del enlace glucosídico β (1→4).El Asp52 se encuentra rodeado de grupos polares y tienen un pK normal, por lo que a pH fisiológico se encuentra ionizado. Mientras que el Glu35 está en una región apolar lo que le permite estar protonado a pH fisiológicos. Glu35 y Asp52  son  fundamentales en la acción catalítica. El pH tiene influencia en este mecanismo de catálisis porque cuando este aumenta el Glu se ioniza, mientras que si elpH disminuye es el Asp el que se protona.
Objetivo:
→Desarrollar un método de purificación de la lisozima más eficaz mediante comparación de distintos procesos de purificación y análisis de datos de los mismos.
→Determinar la actividad enzimática de la proteína.

Materiales y métodos:
Materiales:
-Material biológico: huevo de gallina
-Ácido acético 0.1 M (utilización en la columna deSephadex y diluciones de clara de huevo)
-1 mL de mezcla de azul de dextrano y ferricianuro potásico en ácido acético.
-Sephadex G75
-Tampón fosfato potásico 0.1 M, pH= 6.6
-Paredes de micrococcus lysodeikticus 0.3 mg/mL en tampón fosfato 0.1 M, pH=6.6
-Reactivo de Bradford (Biorad)= 100 mg de azul de Coomassie G-250 + 50 mL de etanol 95% (v/v) + ác. Fosfórico al 85% (p/v). Se diluye hastaalcanzar 1 L.
-BSA 1 mg/mL
-Reactivos necesarios para la preparación del gel de electroforesis.

Métodos:
* Método de Bradford: (Anal. Biochem. 72, 248-254). En medio ácido la unión de azul de Coomassie a proteínas causa un desplazamiento en la λ del máximo de Absorción (λ=465 nm→λ=595 nm) demostrando que la [prot] está directamente relacionada con la Absorbancia a 595 nm.
* Ensayoenzimático: es un método de activación de la lisozima mediante pared celular de micrococcus lysodeikticus.
* Electroforesis: “Técnicas instrumentales de análisis en Bioquímica”; Cap. 5; pp.224-232;
ed. Sintesis; García-Segura J.M., Gavilanes J.G. et al.
* Cromatografía de penetrabilidad: “Técnicas instrumentales...