Release Of EIF6

Liberación de eIF6 en ribosomas

El ensamblaje de los ribosomas 80S requiere la unión de las subunidades 40S y 60S, que es provocada por la formación de un complejo de iniciación en la subunidad 40S. Este evento limita la velocidad de la traducción, y depende de los estímulos externos y el estado de la célula. Aquí mostramos que las subunidades 60S son activadas por la liberación de eIF6(también denominado p27BBP). En el citoplasma, elF6 está ligado a la subunidad libre 60S pero no a 80S. Además, eIF6 interactúa en el citoplasma con RACK1, un receptor para proteína cinasa C activa (PKC). RACK1 es un componente importante del acarreamiento de ribosomas, que albergan cantidades significativas de PKC. Cargando las subunidades 60S con eIF6 causó un bloqueo de la traslación dependiente de ladosis y el deterioro de la formación de 80S, que se invierte mediante la expresión de RACK1 y la estimulación de la PKC in vivo e in vitro. PKC conduce a la estimulación de fosforilación eIF6, y la mutación de un residuo de serina en el carboxilo terminal de eIF6 deteriorado RACK1 / PKC - mediada por rescate de traslación. Proponemos que la liberación de eIF6 regula subunidad de unión, y que RACK1proporciona una conexión física y funcional entre la señalización de la PKC y la activación ribosomal.
eIF6 es en parte nucleolar in vivo, y su agotamiento deteriora la biogénesis de las subunidad 60S ribosomal. Sin embargo, eIF6 es desconcertante ya que mantiene las subunidades 40S y 60S disociadas in vitro. Este hallazgo condujo a la propuesta de que eIF6 es una iniciación factor11. Su papel enla traducción no se conoce, por lo que se dirigió a esta cuestión en las células de mamíferos. Perfiles de los extractos celulares solubles muestran que eIF6 es endógeno, ya sea libre o unido libera 60S subunidades pero no subunidades 80 y polisomas (varios ribosomas) (Complementario Fig. 1a). Además, eIF6 endógeno se encuentra principalmente en el citoplasma (Suplementario Fig. 1b), donde lapartición (analizada por filtración en gel) en dos formas es igualmente representado, uno como monomérica (masa molecular relativa, Mr ¼ 2.62 x 103) y uno con una masa molecular más alta (Vo +- 1.3 x 106 Mr; ribosoma Mr ¼ 2.82 x 106 ) ), Lo que sugiere que están asociados; eIF6 con los ribosomas citoplasmicos (Suplementario Fig. 1c).
Para identificar los factores que interactúan directamente conelF6, se realizó la hibridación de dos levaduras, el cual condujo el aislamiento de RACK1, un receptor para PKC12-14 y un protein15 de sostén (scaffold). En estudios posteriores in células A431, elF6 endógeno co-inmunoprecipitado con RACK1 endógeno (Fig. 1a) y purificado por afinidad de extractos con proteínas de unión a maltosa (MBP)-RACK1 resultando un enriquecimiento del elF6 endógeno (Fig. 1b).Experimentos mostraron que eIF6 recombinante se une directamente inmovilizando RACK1. Por lo tanto elF6 puede unirse directamente a RACK1 in vivo.
Estudios de inmunofluorescencia muestran que RACK1 endógeno está presente en el citoplasma pero no en el núcleo; elF6 fue detectada en ambos compartimentos. En general los datos sugieren que la interacción entre RACK1 y elF6 toma lugar en el citoplasma.La presencia de elF6 en los ribosomas y su habilidad para unirse con RACK1 nos guía a investigar la asociación RACK1-ribosoma. El análisis polisomal (o polisómico) mostró que RACK1 endógeno estaba presente en los ribosomas y polisomas, así como en la fracción del citoesqueleto (Fig. 1e). En el mismo gradiente, eIF6 se encontró en la fracción del citoesqueleto (en los filamentos intermedios, comoen la ref. 5), en la fracción libre y en los ribosomas 60S (Fig. 1E). En las subunidades ribosomales nativas purificadas de células HeLa, RACK1 parecen estar asociadas principalmente con las subunidades 40S (Complementario. Figura 2b-c) y también se enriqueció en lisados de reticulocitos de conejo (Fig. 2d). Por lo tanto, RACK1 y eIF6 están presentes en los ribosomas, pero sus posiciones...