Separación y estudio de una mezcla triproteica de Albumina serica de bovina, Fosfatasa ácida de germen de trigo y Citocromo c


UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE
Facultad de Química y Biología
Laboratorio de bioquímica

Separación y estudio de una mezcla triproteica de Albumina serica de bovina, Fosfatasa ácida de germen de trigo y Citocromo c


Resumen

Las tres experiencias que se realizaron hasta el momento se fundamentan sobre la separación de una mezcla proteica que contenía Albúmina sérica bovina(BSA, 66,3 kDa), Fosfatasa ácida del germen del trigo (65 kDa) y Citocromo C (13 kDa), donde a partir de ellas lograremos calcular las concentraciones y verificar el grado de pureza de sus fracciones, a la vez de determinar las proteínas presentes en cada una de ellas. El proceso de separación fue realizado mediante cromatografía de exclusión molecular y posteriormente nos apoyamos en la confecciónde un cromatograma en el cual se debería determinar que en la extracción n°…se encontraba la fostatasa con BSAy en el n° el citocromo C. Por otro lado se utilizó el Método de Bradford para cuantificar la concentración de proteínas. A través de una curva de calibración de absorbancia vs concentración de una proteína estándar con una concentración definida se calculó las respectivasconcentraciones de dichas proteínas. Por último pero , se realizó una separación de electroforesis con gel poliacrilamida, se pudo aislar las proteínas según la masa molecular, con respecto a una muestra estándar conocida. Así fue posible separar las proteínas de la mezcla inicial y determinar sus concentraciones y pesos moleculares respectivos.








Introducción

Elestudio de las macromoléculas ha permitido conocer en detalle su funcionamiento y estructura, desarrollándose diferentes aplicaciones biotecnológicas en áreas que involucran bio-procesos. Las proteínas corresponden a una de las macromoléculas que dirigen un sin número de reacciones químicas en la célula, siendo muy selectivas y específicas al momento de actuar. Para estudiar las proteínas esnecesario purificarlas y/o aislarlas, lo cual se puede hacer a través de diferentes métodos. Uno de ellos es la cromatografía, técnica que permite la separación de diferentes moléculas en una misma mezcla. Un tipo específico de cromatografía es la de exclusión molecular, una de las técnicas más sencillas empleada para la separación de proteínas; cuenta con una fase estacionaria, generalmente un gel, y unafase móvil que arrastra la muestra, separándola de acuerdo a la diferencia de tamaño de las partículas, debido a la entrada selectiva de partículas de menor masa molecular en el gel, retrasándolas. Se puede medir la absorbancia de fracciones recolectadas de la columna, para la confección de un cromatograma (en el cual se espera observar 3 peaks), donde se puede saber cuales de esas fraccionesposeen la proteína separada.
Para determinar la concentración de proteínas aisladas, existen distintos métodos que dependen de la muestra y de la sensibilidad que se desee, entre ellos se encuentra el Método de Bradford que se basa en la unión del colorante Coomassie blue a las proteínas, para estimar la cantidad de proteína.  La ley de Lambert-Beer nos permite saber la concentración de una muestra,en base a la absorbancia, las que  presentan un comportamiento lineal en cierto rango. Esta ley se cumple para concentraciones diluidas y se aplica luego de obtener la curva de calibración de un compuesto, donde se separan distintas concentraciones del mismo, determinando para cada una de ellas un valor de absorbancia a una longitud de onda máxima. Está descrita por la siguiente ecuación:(Ecuación 1)




Donde: A= Absorbancia
            ε= Coeficiente de extinción molar
[M-1cm-1]
            d= Distancia que recorre la luz por la disolución [cm]
            C= Concentración de la muestra [M]

Para determinar la masa molecular de una proteína y además su punto isoeléctrico es posible realizar el proceso de electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecíl sulfato...