SESION 8 CLONAMIENTO

Clonación de genes
Una clona es definida como un gran numero de células o moléculas
todas idénticas provenientes de un origen único
Clonación del DNA ha sido posible por:
Enzimas de restricción.
La capacidad de los vectores de clonación de multiplicarse después
que DNA ha sido insertado en su genoma.

Clonación del DNA
Es la inserción de DNA en un vector de clonación y luego este
vector con elDNA debe ser introducido en bacterias o levaduras
u otra célula hospedera.

QUE SE PUEDE CLONAR
1. Un gen o una secuencia
2. Todo el genoma de una célula: Librería genomica.
3. Todo lo que se transcribe de una célula (transcriptoma): Librería de cDNA

Proceso de clonación involucra:
A.

DNA blanco (producto de PCR o RT-PCR)

B.

Un vector de clonación

C.

Célula hospedera

D.

Método deintroducir lo ligado al vector de clonacion en la celula hospedera

E.

Método de tamizaje del inserto clonado.

Clonación requiere:
A. DNA Blanco:
PCR: Primers especificos y purificar el fragmento amplificado
RT-PCR: cDNA y luego primers especificos y purificar el fragmento amplificado.
B. Vectores de Clonacion-Expresión: Elementos
Plásmidos, cosmidos, fagos, Bac, Yac, etc.

C. Célula hospedera:
E.coli, levaduras, Células de insectos.

D. Métodos de transformación:
Infectividad.
Cloruro de calcio, cloruro de litio, liposomas, etc.
Electroporacion, balistica o shot gun.

Método de tamizaje de la presencia del inserto.
- Inicialmente, que la bacetria crezca en presencia del marcador de selección.
- Cambio de coloración de la colonia bacteriana.
- PCR
- Miniprep y digestión con enzimas derestricción.
- Hibridización con una sonda
- Evaluando la expresión o actividad de la proteína.

Esquema general de clonación de una secuencia o DNA

Vector

Célula hospedera
Tranformación

DNA a clonar

Selección de clonas

Amplificación de un fragmento de DNA: se puede lograr en una
célula usando vectores de clonación como plásmidos y
bacteriófagos.

"Vector" es un agente que puede llevar unfragmento de DNA dentro de
una célula hospedera. 
Vector de clonación”.
Vector de expresión:

Si es usado para reproducir el fragmento de
DNA.
Si es usado para expresar cierto gen.

Cosmidos

Bac

YAC

Eco RI

Bam HI

Fagos

Sal1

Pst1

Sphl

Plásmidos

Hind III

Tipos de Vectores:

LacZ
AmpR

Eco RI

Cos

Cos

Ori

Brazo Izq.

plásmido

Lac Z

Brazo Der.

Fago Lambda

Sitio de
Clonación

Cos

EcoRI

Cos

TEL

A

ARS

B

CEN

Brazo Izq.

Cosmido

Brazo Der.

YAC

Vectores de Clonación y Vectores de expresión

TEL

Tipos de vectores
Vector

Cel. huesped

Plasmids

Bacteria

Tamaño
inserto
Hasta 15 kb

Bacteria virus
(lambda)

Bacteria

Hasta 25 kb

Bacteria

100-500 kb

(yeast
artificial
chromosome)

Yeast

250-1000 kb

Cosmid

Bacteria

30-45 kb

BAC

(bacterial
artificial
chromosome)YAC

PLASMIDOS
Son DNA circular (excepciones) de doble cadena que existen en
bacterias y en el núcleo de algunas células eucarióticas. Se pueden
replicar independientemente de la célula hospedera. El tamaño de un
plasmido oscila entre unas pocas kilobases hasta 100 kb.

Propiedades deseables de un plasmido:
 Debería ser pequeño.
 Secuencia debería ser conocida.
 Alto numero de copias. Origen dereplicación
 Debe contener un marcador de
selección.
 Debería contener un segundo
marcador de selección que se inactive
por la inserción del DNA clonado.
 Tener un gran numero de sitios únicos
para ER en uno de los dos marcadores
de selección.
LacZ codifica la -galactosidasa.
Lacl – codifica el factor que controla la
transcripcion of lacZ.

Clonación en plásmidos

Clonación ExtremosCohesivos

Clonación Modificando
Extremos

Fagos:
Son virus que infectan bacterias. La principal ventaja de estos vectores es
su alta eficiencia de transformación, alrededor de 1000 veces mas que un
vector tipo plásmido.

Clonación en Fago Lambda

Cosmidos
Son una combinación de un plasmido y los sitios cos, lo cual permite
empaquetar este DNA en la cabeza de un virion y luego ser introducido
en...