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3 Manipulación genética.
La investigación genética necesita la manipulación de ADN para poder construir teorías sobre los mecanismos
que suceden en las células in vivo y elucidar la estructura del genoma y su organización (intrones, exones,
elementos de regulación), también para poder desarrollar técnicas nuevas de curación y terapia mediante la
caracterización de los genes terapéuticamenteinteresantes, y para la fabricación de plantas y animales de las
características deseadas, con un mayor rendimiento agrícola y ganadero. Es importante mantener siempre en
el pensamiento que la manipulación genética sirve un fin muy determinado, que a veces se difumina cuando
se entra en profundidades técnicas.
Técnicas básicas.
Hay que tener en cuenta que toda la manipulación genética implicaun aislamiento del medio celular, por lo
que las condiciones de experimentación son todas in vitro, y no tienen nada que ver con el metabolismo de las
ácidos nucleicos. Con esta premisa en mente, los resultados que se pudieran obtener mediante estas técnicas
siempre deberán ser contrastados y verificados antes de extrapolarlos a la situación de un organismo vivo.
Estas técnicas utilizan lasenzimas presentes en las células como herramientas para poder cortar, empalmar,
duplicar, amplificar y recombinar los fragmentos de ADN con los que se trabaja; en suma, las enzimas
efectúan las mismas funciones que en el medio fisiológico, pero libres de todo factor de regulación, para hacer
su actividad más predecible y permitir una manipulación al antojo del experimentador. Ésta es la principaldiferencia entre los sistemas in vivo e in vitro.
Degradación de ácidos nucleicos.
Métodos químicos.
Desde hace mucho tiempo se conoce la degradación química de los ácidos nucleicos mediante cambios de pH
(hidrólisis ácida o alcalina, despurinización), pero son métodos demasiado radicales e incontrolables, por lo
que su utilización está muy limitada a determinados fines, como el cálculo delporcentaje de bases. Los ácidos
nucleicos tienen distintas sensibilidades a la hora de sufrir una hidrólisis: a pH muy bajos (1) se obtiene un
hidrolizado total de todos los ácidos nucleicos (azúcares, fosfatos y bases), a pH = 4 se hidrolizan sólo los
enlaces glucosídicos (más en el ADN que en el ARN), a un pH neutro los ácidos nucleicos son estables (más
el ADN que el ARN), y a pH alcalino(11) el ADN es estable, pero el ARN se hidroliza dando nucleósidos 2'
y 3'−fosfato, por el efecto de la catálisis básica que ejerce el 2'−OH (esta distinción es útil cuando se quiere
eliminar el ARN de un aislado de ácidos nucleicos).
Métodos enzimáticos.
Las técnicas de manipulación enzimática de los ácidos nucleicos son mucho más finas y específicas que las
anteriores, por lo que se puedehablar de disección génica. Las enzimas, llamadas nucleasas, se extraen de
diversos organismos, generalmente microscópicos, y hay de todos los tipos: endo− y exonucleasas, ADN o
ARNasas, específicas de secuencia o no, específicas de hebra sencilla o de doble hebra, y todas las
combinaciones entre ellas. En la siguiente lista se detallan algunas de las más utilizadas.
ADNasa I.
Es unaendonucleasa de E. coli que corta ADNds y ADNss, sin especificidad de secuencia, pero
preferentemente detrás de pirimidinas. El corte al azar sobre ADNds se realiza en distintos sitios en cada
hebra si el medio tiene Mg2+, pero si el catión es Mn2+ los dos cortes están generalmente en el mismo sitio.
El uso indiscriminado (al azar) de esta enzima permite determinar zonas de actividad de la cromatina
1mediante la mayor abundancia de cortes, lo que significaría que el ADN está más expuesto al corte.
Exonucleasa III.
Otra enzima de E. coli que elimina nucleótidos uno por uno desde los extremos 3'−OH. Actúa sobre todos los
tipos de ADNds que tengan esos extremos (lineal y circular con una muesca), y en los ADNds se utiliza para
fabricar extremos cohesivos (extremos de una molécula de...