Técnicas para determinar antioxidantes

NOMBRE: BETEL CASTILLO UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PANAMÁ


MÉTODOS PARA MEDIR CAPACIDAD ANTIOXIDANTE



Método por diferencia de pH. Permite la estimación alternativa del contenido de antocianos totales [13]. Se utilizan dos sistemas tampón: ácido clorhídrico/ cloruro de potasio de pH 1,0 (0,025 M) y ácido acético/ acetato sódico de pH 4,5 (0,4 M). A 0,2mL de una muestra diluida (para conseguir una absorbancia en el rango de 0,100-1,200 a 510 nm) se añaden 1,8 mL de la corres-pondiente disolución tampón y se mide la absorbancia frente a un blanco a 510 y 700 nm. Se calcula la absor¬bancia final a partir de:
A = (Amax. vis – A700 nm)pH1,0 - (Amax vis – A700 nm)pH4,5

La concentración de pigmentos monoméricos en el extracto se expresa encianidina-3-glucósido.
Antocianos monoméricos (mg/100 g) = A x PM x FD x 100
(ε x 1)
A = Absorbancia; PM = peso molecular
FD = Factor de dilución; ε = absortividad molar
La concentración final de antocianos (mg/100 g) se calcula en base al volumen de extracto y peso de muestra. Se expresa en cianidina 3-glucósido (PM: 449,2 y ε: 26900).Determinación de fenoles totales (FT)
El método espectrofotométrico desarrollado por FOLIN y CIOCALTEAU [10], para la determinación de fenoles totales, se fundamenta en su carácter reductor y es el más empleado. Se utiliza como reactivo una mezcla de ácidos fosfowolfrámico y fosfomolibdíco en medio básico, que se reducen al oxidar los compuestos fenólicos, originando óxidos azules de wolframio(W8O23) y molibde¬no (Mo8O23). La absorbancia del color azul desarrollado se mide a 765 nm. Los resultados se expresan en mg de ácido gálico por 100 g de pulpa de frutos.
Actividad antioxidante
- Método ABTS
Según la metodología desarrollada por RE et al. [38] y descrita por KUSKOSKI et al. [25] el radical ABTS•+ se obtiene tras la reacción de ABTS (7 mM) con persulfato potásico (2,45 mM,concentración final) incubados a tem¬peratura ambiente (±25ºC) y en la oscuridad durante 16 h. Una vez formado el radical ABTS•+ se diluye con etanol hasta obtener un valor de absorbancia comprendido entre 0,70 (±0,1) a 754 nm (longitud de onda de máxima absor¬ción). Las muestras filtradas (antocianos) se diluyen con etanol hasta que se produce una inhibición del 20 al 80%, en comparación con laabsorbancia del blanco, tras añadir 20 μL de la muestra. A 980 μL de dilución del radical ABTS•+ así generado se le determina la A754 a 30ºC, se añade 20 μL de la muestra (dilución de antocianos) y se mide de nuevo la A754 pasado 1 minuto. La absorbancia se mide de forma continua transcurridos 7 minutos. El antioxidante sinté¬tico de referencia, Trolox, se ensaya a una concentración de 0-15 μM(concentración final) en etanol, en las mismas condiciones, lo que se hace también con ácido ascórbico (0-20 mg/100 mL). Los resultados se expresan en TEAC (actividad antioxidante equivalente a Trolox) y en VCEAC (actividad antioxidante equivalente a vitamina C), en este último caso por tratarse de alimentos.

- Método DPPH
Este método, desarrollado por BRAND-WILLAMS et al.[6], se basa en lareducción de la absorbancia medida a 515 nm del radical DPPH•, por antioxidantes. Con mo¬dificaciones el método descrito por KIM et al.[23], se basa en la medida de la absorbancia del radical DPPH• 100 μM (3,9 mL) disuelto en metanol al 80%, a la longitud de onda de 517 nm. Se añade 0,1 mL de la muestra o patrón, la mezcla se homogeniza cuidadosamente, y se mantiene en la oscuridad durante 30minutos. Las medidas de absorbancia a 517 nm se realizan antes de añadir la muestra (A0) y pasados los 30 y 60 minutos (Af). La concentración de DPPH• en el medio de reacción se calcula a partir de una curva de calibrado obtenida por regresión lineal. Los resultados se expresan en TEAC, o sea, actividad equivalente a Trolox (μM/g de muestra peso fresco). El antioxidante sintético de referencia Trolox,...