TECNICA DE CITOMETRIA

Separación de células mononucleares de sangre periférica:

Para iniciar cada una de las tinciones es necesario obtener células mononucleares de sangre periférica, mediante punción venosa, a travésdel siguiente procedimiento:
1. se obtendrán muestras de sangre venosa con EDTA como anticoagulante.
2. Se diluirá la sangre volumen/volumen con buffer salino de fosfatos PBS (del ingles PhosphateBuffering Saline) pH 7.3, se mezclara en un tubo conico de 15 mL, con 4 mL de gradiente de separación Lymphoprep de NycomedTM (con una densidad de 1.077)se le adicionara 10 mL de la dilución de lasangre, con cuidado de no mezclar las fases
3. Se centrifugara por 30 minutos a 560 g a temperatura ambiente
4. Se recuperara el anillo correspondiente a las células mononucleares con una pipeta Pasteur,depositándolas en otro tubo conico de 15 mL
5. Posteriormente se realizaran dos lavados a las células, cada uno con 10 mL de PBS y se centrifugaran a 830 g, durante 10 minutos a temperatura ambiente
6.Se medirá la viabilidad celar con azul de tripano al 0.04% y se cuantificaran las células en cámara de Neubauer con liquido de Turck.


Tinción directa para marcadores de superficie CD14, CD62L,TNF-α


1. Colocar 500,000 células en un microtubo de 1.5 mL
2. Adicionar 5 µL de cada uno de los anticuerpos monoclonales marcados con FITC, PE y PC5
3. Incubar en oscuridad por 30 minutos a 4oC
4. Lavarcon 1 mL de PBS a 1593 g por 1 minuto, y se retiro el sobrenadante, re suspendiéndose las células
5. Finalmente se fijaran las células con una solución de formaldehido al 0.5% en PBS y se cambiaran atubos de polipropileno de 12 x 75 mm y se almacenaran a 4oC en obscuridad



No. De tubo y marcaje
Fluorocromo
FITC
Fluorocromo
PE
Fluorocromo
PC5
1.- Células solas
-
-
-
2.- Control de isotipo
IgG1(isotipo)
IgG1 (isotipo)
IgG1 (isotipo)
3.- CD62L/PE/PC5
CD62L
IgG1 (isotipo)
IgG1 (isotipo)
4.- FITC/ TNF-α/PC5
IgG1 (isotipo)
TNF-α
IgG1 (isotipo)
5.- FITC/PE/CD14
IgG1 (isotipo)
IgG1 (isotipo)...