Tecnicas ingenieria genetica

Tecnicas de ingeniería genética
Clonación de DNA en Escherichia coli.
más utilizado cepa de laboratorio K12 E.coli. Se utilizan como huésped y aceptan infinidad de vectores, incluyendo los plásmidos, los fagos y los cósmidos.
PARA CREAR MOLÉCULAS DE DNA RECOMBINANTE SE PRECISAN VARIOS PASOS. SI SE UTILIZA UN PLÁSMIDO COMO VECTOR, EL PROCEDIMIENTO ES EL SIGUIENTE:
1. El DNA a clonar seaísla y se trata con una enzima de restricción para crear fragmentos que acaben en secuencias específicas.
2. Los fragmentos se ligan a moléculas de plásmido que han sido cortadas con la misma enzima de restricción, obteniéndose un vector recombinante.
3. El vector recombinante se transfiere a células huésped bacteriano, por transformación, un proceso en el que las moléculas de DNA cruzan lamembrana de la célula huésped transfiriéndose a su interior.
4. La célula huésped se hace crecer en una placa de cultivo, donde formará colonias. Puesto que las células de cada una de las colonias provienen de una sola célula inicial, son clones. Se rastrean las colonias para identificar las que han incorporado el plásmido recombinante.
La cepa de E.coli huésped carece de enzimas de restricción yes recA- (carece del gen que codifica la proteína RecA, una ATPasa necesaria para los procesos de recombinación genética)
Los vectores plasmídicos penetran en las células de E.coli mediante un proceso de transformación inducido por cloruro cálcico o mediante electroporación a 3-24 kV /cm, que es eficaz en bacterias tanto Gram positivas como gram negativas.

Métodos para seleccionar las coloniasque contienen plásmidos con el inserto de DNA. Se denomina “rastreo” (o “cribado”).
Para vectores como pBR322, el rastreo es un proceso que consiste en dos etapas :
1.- Si el DNA que se desea clonar se inserta dentro del gen de resistencia a tetraciclina, este gen se inactivará. Después de transformar células huésped con el plásmido recombinante, éstas se hacen crecer en placas de cultivoque contienen el antibiótico ampicilina. Todas las células que hayan incorporado un plásmido (con o sin inserto) crecerán y formarán colonias, mientras que las células que no lo hayan incorporado morirán ya que son sensibles a la ampicilina.
2.- Se identifican las colonias que contienen plásmidos con el inserto de DNA. Se transfieren las colonias de la placa que contiene ampicilina a una placaque contiene tetraciclina mediante un procedimiento denominado “réplica”.
3.- Las colonias que contienen el plásmido con el inserto no crecerán en la placa con tetraciclina, debido a que el inserto ha inactivado el gen de resistencia a tetraciclina. Entonces, el patrón de colonias de la placa con tetraciclina se compara con el de la placa con ampicilina, y se identifican las colonias de la placacon ampicilina que no han crecido en la placa con tetraciclina. Las células de estas colonias contienen vectores con el inserto de DNA, y se transfieren a un medio de crecimiento para nuevos análisis.

Selección de colonias que contienen un vector plasmídico que tiene dos genes de resistencia a antibióticos, uno para tetraciclina y otro para ampicilina. En este experimento, la presencia delinserto de DNA en el plásmido inactivará el gen de resistencia a la tetraciclina. Primero, se hacen crecer las células transformadas con el plásmido recombinante en un medio que contiene ampicilina. Como las células huésped son sensibles a ampicilina y el plásmido tiene un gen de resistencia a ampicilina, sólo crecerán aquellas células que hayan incorporado el plásmido. Se prepara una réplica de lascolonias con un trozo de terciopelo estéril. Al presionar el terciopelo sobre la placa, algunas células de cada colonia se pegarán a él. Luego se presiona el terciopelo sobre la superficie de una placa que contiene tetraciclina.
Las células que contienen los plásmidos con inserto no crecerán ya que se ha inactivado el gen de la tetraciclina. Comparando el patrón de colonias de la placa con...