Tecnicas Moleculares
Páginas: 19 (4513 palabras)
Publicado: 17 de octubre de 2011
HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Introducción
La técnica de hibridación de ácidos nucleicos, es una técnica muy importante, aplicada en todas las áreas de la Biología Molecular e Ingeniería Genética, en especial en la Patología Molecular (1). Esta basada en el proceso de renaturalización de dos cadenas sencillas de ácido nucleico (1,2,3,4,5) cuyo origen es distinto (4), uno marcado, queactúa como sonda, y otro que actúa como diana o blanco de hibridación, no marcada (1,2), éstas pueden ser híbridos ADN-ADN, híbridos ARN-ARN (homodúplex) o híbridos ADN-ARN (heterodúplex) (1,3), siempre que ambas cadenas tengan una secuencia de nucleótidos complementaria (3,6).
Cuando hablamos del fenómeno de renaturalización de los ácidos nucleicos, debemos comenzar por explicar el dedesnaturalización y de ésta forma comprender mejor la técnica. El proceso de desnaturalización puede ser provocado por agentes químicos que provoquen alteraciones extremas en el pH, y/ó por medios físicos, que eleven la temperatura (1,3); estos agentes desnaturalizan los ácidos nucleicos, es decir hacen que pierdan su conformación tridimensional rompiendo los puentes de hidrógeno entre pares de bases, así comolas interacciones hidrofóbicas entre bases apiladas (1,3). Al desnaturalizarse las dos hebras del DNA se separan y pasan a una conformación al azar, sin que se altere la estructura primaria, pues no hay ruptura de enlaces covalentes. En el caso de los ARN, con muy distinta conformación tridimensional a pesar de su analogía en estructura primaria, la desnaturalización afecta fundamentalmente a losARN de transferencia y a los ARN ribosomales, ya que son los que presentan regiones en doble hélice (1).
Agentes desnaturalizantes y renaturalización
Temperatura
La temperatura, es el agente desnaturalizante más representativo, en donde el calentamiento gradual del ADN debilita las fuerzas estabilizadoras de la doble hélice, de forma que las dos hebras se desenrollan hasta su separacióntotal. En este proceso de desnaturalización se pierde la estructura secundaria y superiores. Posteriormente, si el enfriamiento se hace lentamente y sin llegar a bajas temperaturas (hasta 20-30°C), hay posibilidad de que las secuencias complementarias se “encuentren” y se formen de nuevo los puentes de hidrógeno entre las hebras (“templado”). La mayor parte de las cadenas sencillas forman el mismoADN doble original: se produce la renaturalización del ADN, es decir, la desnaturalización es reversible. Si después del aumento gradual de temperatura, se enfría rápidamente el sistema (mezcla de ADN de hebra sencilla) las cadenas quedan disociadas: la desnaturalización es irreversible y se ha perdido la funcionalidad (1).
El proceso de desnaturalización se emplea, para el estudio de laestructura del ADN, mientras que la renaturalización es útil como base de las técnicas de hibridación. Ambas son muy importantes en la técnica de PCR (1).
Acción de sustancias ácidas y básicas
El apareamiento de las bases disminuye o se debilita por valores de pH alejados de la neutralidad, con la consiguiente desnaturalización del ADN, sin embargo, un medio ácido puede conducir también a laruptura de la estructura primaria de los ácidos nucleicos, por ello, para la desnaturalización del ADN es más habitual emplear condiciones alcalinas (a las cuales el ADN, a diferencia del ARN, es estable). La naturalización del medio puede permitir la recuperación de la estructura de partida, es decir, la renaturalización del ADN (sucede de forma similar a la desnaturalización por calor) (1).
Agentesquímicos
Algunos de los compuestos empleados con frecuencia para desnaturalizar el ADN son moléculas sencillas, altamente polares, con grupos amino y carbonilo, mismos que les permiten competir en la formación de enlaces de hidrógeno con los grupos amino y carbonilo propios de las bases, facilitando así la ruptura de sus apareamientos y la consiguiente separación de las hebras. Algunos...
Introducción
La técnica de hibridación de ácidos nucleicos, es una técnica muy importante, aplicada en todas las áreas de la Biología Molecular e Ingeniería Genética, en especial en la Patología Molecular (1). Esta basada en el proceso de renaturalización de dos cadenas sencillas de ácido nucleico (1,2,3,4,5) cuyo origen es distinto (4), uno marcado, queactúa como sonda, y otro que actúa como diana o blanco de hibridación, no marcada (1,2), éstas pueden ser híbridos ADN-ADN, híbridos ARN-ARN (homodúplex) o híbridos ADN-ARN (heterodúplex) (1,3), siempre que ambas cadenas tengan una secuencia de nucleótidos complementaria (3,6).
Cuando hablamos del fenómeno de renaturalización de los ácidos nucleicos, debemos comenzar por explicar el dedesnaturalización y de ésta forma comprender mejor la técnica. El proceso de desnaturalización puede ser provocado por agentes químicos que provoquen alteraciones extremas en el pH, y/ó por medios físicos, que eleven la temperatura (1,3); estos agentes desnaturalizan los ácidos nucleicos, es decir hacen que pierdan su conformación tridimensional rompiendo los puentes de hidrógeno entre pares de bases, así comolas interacciones hidrofóbicas entre bases apiladas (1,3). Al desnaturalizarse las dos hebras del DNA se separan y pasan a una conformación al azar, sin que se altere la estructura primaria, pues no hay ruptura de enlaces covalentes. En el caso de los ARN, con muy distinta conformación tridimensional a pesar de su analogía en estructura primaria, la desnaturalización afecta fundamentalmente a losARN de transferencia y a los ARN ribosomales, ya que son los que presentan regiones en doble hélice (1).
Agentes desnaturalizantes y renaturalización
Temperatura
La temperatura, es el agente desnaturalizante más representativo, en donde el calentamiento gradual del ADN debilita las fuerzas estabilizadoras de la doble hélice, de forma que las dos hebras se desenrollan hasta su separacióntotal. En este proceso de desnaturalización se pierde la estructura secundaria y superiores. Posteriormente, si el enfriamiento se hace lentamente y sin llegar a bajas temperaturas (hasta 20-30°C), hay posibilidad de que las secuencias complementarias se “encuentren” y se formen de nuevo los puentes de hidrógeno entre las hebras (“templado”). La mayor parte de las cadenas sencillas forman el mismoADN doble original: se produce la renaturalización del ADN, es decir, la desnaturalización es reversible. Si después del aumento gradual de temperatura, se enfría rápidamente el sistema (mezcla de ADN de hebra sencilla) las cadenas quedan disociadas: la desnaturalización es irreversible y se ha perdido la funcionalidad (1).
El proceso de desnaturalización se emplea, para el estudio de laestructura del ADN, mientras que la renaturalización es útil como base de las técnicas de hibridación. Ambas son muy importantes en la técnica de PCR (1).
Acción de sustancias ácidas y básicas
El apareamiento de las bases disminuye o se debilita por valores de pH alejados de la neutralidad, con la consiguiente desnaturalización del ADN, sin embargo, un medio ácido puede conducir también a laruptura de la estructura primaria de los ácidos nucleicos, por ello, para la desnaturalización del ADN es más habitual emplear condiciones alcalinas (a las cuales el ADN, a diferencia del ARN, es estable). La naturalización del medio puede permitir la recuperación de la estructura de partida, es decir, la renaturalización del ADN (sucede de forma similar a la desnaturalización por calor) (1).
Agentesquímicos
Algunos de los compuestos empleados con frecuencia para desnaturalizar el ADN son moléculas sencillas, altamente polares, con grupos amino y carbonilo, mismos que les permiten competir en la formación de enlaces de hidrógeno con los grupos amino y carbonilo propios de las bases, facilitando así la ruptura de sus apareamientos y la consiguiente separación de las hebras. Algunos...
Leer documento completo
Regístrate para leer el documento completo.