tecnicas moleculares




CURSOS DE ACTUALIZACION DE BACTERIOLOGIA IV MODULO
APLICACIÓN DE TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR PARA DETECCION DE BACTERIAS

CATEDRATICO
JUAN MANUEL ZALDIVAR CRUZINTRODUCCION

Las ventajas de las técnicas moleculares ha sido ampliamente publicitadas en los últimos 7 años, lo que sin duda ha aumentado la presión en los laboratorios clínicos para comenzar a usarlas en una amplia variedad de enfermedades infecciosas, genéticas, oncológicas y neurológicas.
Actualmente existe una variedad de paquetes comerciales,especialmente en el área de las enfermedades infecciosas, que contienen todo lo necesario para realizar un examen, lo que obviamente ha estimulado a los laboratorios a incluir técnicas de biología molecular en el diagnóstico clínico. Sin embargo, y como veremos más adelante, estos métodos moleculares no están exentos de problemas tanto en su ejecución como en su interpretación, por lo que debieran estarreservados para aquellos laboratorios con personal familiarizado con estas técnicas y que tengan la infraestructura necesaria para su realización.








TÉCNICAS O MÉTODOS USADOS EN BIOLOGÍA MOLECULAR
En general, las técnicas más usadas son las de detección directa por hibridación, usando un segmento de ADN marcado, y las técnicas de amplificacion. Estas últimas han tenido unaverdadera explosión en su metodología, como lo demuestra el que en la actualidad existan por lo menos seis técnicas diferentes, aunque todas tienen como finalidad la amplificación de un segmento de ADN o ARN que ha sido seleccionado como un marcador para una determinada patología.
En este artículo me referiré al uso de estas técnicas en el diagnóstico de enfermedades infecciosas basada en laexperiencia personal. Sin embargo, es importante notar que los fundamentos de las técnicas descritas a continuación son similares en la mayoría de los exámenes usados para diagnóstico clínico.

HIBRIDACION POR SONDAS
Las sondas (probes) son segmentos de ADN o ARN que han sido marcados con enzimas, sustratos antigénicos, quimioluminiscencia o radioisópotos, los que se pueden unir con una altaespecificidad a una secuencia complementaria de ácido nucleico. Estas sondas pueden ser dirigidas a un segmento de ADN o ARN seleccionado, que puede tener de veinte a miles de bases de largo. Las sondas de menos de 50 pares de bases son denominadas oligonucleótidos y pueden ser sintetizadas y purificadas con relativa facilidad por instrumentos comerciales actualmente disponibles. Las sondas deoligonucleótidos tienen la ventaja de hibridar más rápidamente a las moléculas blanco (target) y pueden, bajo ciertas condiciones, detectar el cambio de un nucleótido dentro de una secuencia de ácido nucleico.
Existen varias condiciones que afectan el proceso de unión o hibridación entre la sonda y el segmento blanco, como temperatura, concentración de sal y pH de la reacción. Por ejemplo bajas concentracionesde sal y altas temperaturas permiten que sólo el segmento blanco se una a la sonda, miestras que, por el contrario, si la temperatura de la reacción es baja, segmentos no complementarios pueden unirse a la sonsa. Por lo tanto, las condiciones deben ser cuidadosamente controladas para evitar falsos positivos. La detección de la hibridación puede hacerse de varias maneras, dependiendo del métodousado para marcar la sonda. Por ejemplo, si se usa una enzima, la hibridación se puede visualizar por un cambio de color y si se usa quimioluminiscencia, por emisión de luz un luminómetro.
Indicaciones para el uso de sondas o probes en el laboratorio. Las pruebas de hibridación a menudo disminuyen el tiempo necesario para identificar organismos fastidiosos. Además, permiten que los laboratorios...