Trabajo Precipitacion

• Objetivos:

- Separar e identificar los distintos componentes proteicos en una muestra de suero / orina realizando un proteinograma electroforético.
- Evaluar las distintas bandas obtenidas por el método visual, estimando los porcentajes relativos de cada una de ellas, así como su concentración a partir del dato de proteínas totales, las que se determinan por el método de Biuret.
-Relacionar los patrones electroforéticos obtenidos con las distintas patologías.
- Evaluación y separación de las proteínas plasmáticas por técnica de SDS-PAGE.

• Fundamentos teóricos:

Cuando en una determinación bioquímica el valor de las proteínas totales se encuentra fuera del intervalo de referencia, se deben realizar más exámenes para identificar la fracción involucrada en el aumento odisminución de este parámetro. Esto se logra mediante la realización de un proteinograma electroforético en cellogel. Luego para identificar la proteína cuyo valor esta alterado se puede determinar su peso molecular a través de una electroforesis en SDS-PAGE.

La electroforesis en cellogel consiste en el movimiento de partículas cargadas por aplicación de un campo eléctrico externo provenientede una fuente de energía estable. Este principio se aplica a la separación de las fracciones proteicas del suero a partir de su carga eléctrica, por lo cual se trabaja con un buffer a pH constante de 8,6 para que las proteínas adquieran carga negativa proporcional a sus grupos ionizables y así lograr con éxito dicho fraccionamiento.
Se utilizan tiras de cellogel conservadas en metanol al 40% paraevitar que se sequen, lo que modificaría las características y dimensiones del gel.
Al preparar la muestra, tener la precaución de que ésta sea un suero libre de contaminación y hemólisis para que el fibrinógeno no interfiera en la determinación. Realizar la siembra a un centímetro desde el extremo catódico para evitar pérdida de la fracción gama de las inmunoglobulinas por el efectoelecectroendosmótico.
Se debe ajustar la intensidad de corriente dado que a mayor potencial, mayor velocidad de migración, lo que aumenta la generación de calor que si no se disipa adecuadamente desnaturaliza las proteínas. Por este motivo también debemos controlar la temperatura mediante la disminución de la fuerza iónica o refrigerando la cámara de migración.
Se cierra el circuito y dejar correr durante30 minutos. Es importante controlar el tiempo de corrida porque tiempos prolongados ocasionarán un ensanchamiento de las bandas.
Luego de la separación fijar, realizar la tinción utilizando un colorante con afinidad por las proteínas y decolorar para visualizar las bandas que revelarán la posición a la cual han migrado las diferentes fracciones.
Actualmente, la separación electroforéticaofrece una excelente forma de obtener estimaciones semi-cuantitativas de las diferentes fracciones proteicas lo que puede orientar a una determinada patología como puede observarse en los siguientes proteinogramas electroforéticos y curvas realizadas por densitometría:
-Banda Policlonal en enfermedades autoinmunes, infecciones crónicas

Electroforesis en SDS-PAGE es un método analítico de altopoder resolutivo que combina la migración en un campo eléctrico y el tamizado molecular a través de un gel de corrida.
La preparación del gel (polimerización de la acrilamida) necesita de un iniciador como el persulfato de amonio que debe ser preparado insitu, además requiere de la presencia de TEMED como acelerador conservado a 4°C.
Dichos geles poseen un diámetro de poro que dependerá de lasconcentraciones relativas de ambos reactivos durante la polimerización. Esto hace que para un gel dado, los factores determinantes de la separación de las moléculas sean el tamaño molecular y la carga neta de las proteínas.
Para independizarnos de las cargas eléctricas de las mismas y lograr una separación en base a la diferencia de pesos moleculares debemos trabajar con un buffer que proporcione un...