Transformacion Bacteriana

UNIVERSIDAD AUTONOMA DE MEXICO
Facultad de Estudios Superiores Iztacala

Módulo de Bioquímica y Biología Celular

PRACTICA 5 TRANSFORMACION BACTERIANA.

Juan Carlos Rivera Santiz

Fecha deentrega: 17/12/2010.

Tlalnepantla de Baz, Edo. De México.

Transformación Bacteriana de E. coli con el plásmido recombiante pUC18 mas el gen GFP. Se Usara el plásmido (o vector de clonación)pUC18 comúnmente usado en E. coli, este es aislado desde la cepa DH5α de E. coli mediante procedimientos estándar. pUC18 es un plásmido de DNA circular con unas cuantos miles de pares de bases decircunferencia. El plásmido artificial pUC18 ha sido modificado genéticamente para incluir el gen de resistencia a ampicilina (ampR) que es un marcador de selección que permitirá la identificación de lasbacterias transformadas si estas crecen el medio que contiene ampicilina (1,4); y un gen (y su promotor) para la enzima beta-galactosidasa (lacZ). El gen de lacZ contiene un una región de poliadición, conuna serie de sitios únicos de restricción que no se encuentran en ningún otro lugar del plásmido. La digestión del plásmido con la endonucleasa EcoR1 hará un corte en el plásmido que lo linealizarapermitiendo su recombinación con DNA extraño(2,4); en este caso el gen de GFP como reportero de expresion que ha sido cortado con la misma endonucleasa desde DNA aislado de Aequorea victoria.

EcoR1es una enzima endonucleasa aislada desde cepas de E. coli; esta enzima forma parte del sistema de restricción. Se usara esta enzima de restricción para crear “stcky ends” con fin en 5’, la secuenciade acido nucleído donde la enzima cortará es GAATTC, que forma un palíndrome con la secuencia complementaria CTTAAG (3). El plásmido pUC18 ha sido modificado incorporando varias partes de las regionesregulatorias del operon de arabinosa; tanto el promotor (PBAD) como el gen araC están presentes, pero la región del operon araA, araB y araD ha sido reemplazada por el gen para GFP. Esto regulara la...