Transformacion Bacteriana

Trabajo practico 3: Transformación de E.Coli con ADN plasmidico.

OBJETIVO, Transformar E. Coli con el plásmido extraído en el TP 1 y calcular la concentración de nuestro plásmido.
INTRODUCCION
En este trabajo transformaremos bacterias E. Coli con el plasmido pBlescript con el gen de resistencia a antibióticos. Las bacterias como E. Coli pueden intercambiar información genética con el mediou otras bacterias de diferentes maneras. Una de ellas es la transformación.
El principio transformante fue descubierto por una serie de científicos después de diversas investigaciones y experimentos. El primero que empezó con la teoría fue Frederick Griffith, quien en 1928, trabajando con ratones y bacterias que causan neumonía descubrió que al inyectarles bacterias de la cepa R los ratonesvivían, inyectando la bacteria de la cepa S los ratones morían, y al inyectar a los ratones bacterias de la cepa S desnaturalizada a 90º junto con la cepa R, LOS RATONES MORIAN. Esto quería decir que algo de la cepa S (patógena) transformaba a la cepa R (no patógena) en patógena. Pero Griffith no pudo descubrir por qué. Más adelante, en 1944, Averley, Mac Leod y McCarty continuaron la investigación: ala cepa S, una vez desnaturalizada, la trataron con distintas enzimas degradadoras como proteasas, lipasas, RNasas y nucleasas. Al tratar con nucleasas los científicos descubrieron que los ratones VIVIAN. Llegando a la conclusión así que los Ácidos Nucléicos eran el causante de la transformación. Esto genero una gran revolución en la biología de aquel entonces, ya que se creía que la informaciónhereditaria provenía de las proteínas y no de los Genes.
La transformación entonces consiste en que la bacteria incorpore un plásmido. Para que las bacterias incorporen al plásmido, se realizan in vitro (aunque este es un proceso que también sucede in vivo) una serie de procesos para que ellas entren en un estado llamado estado de competencia, donde su membrana se encuentra muy sensible y por lotanto los plásmidos puede entrar fácilmente. Una vez adentro es posible que la bacteria rechace al plásmido y lo degrade, como puede que lo incorpore a su propio cromosoma, como también puede quedar dentro de la bacteria y replicarse autónomamente de los cromosomas.
Para tener una idea de cuantas colonias es posible obtener con nuestras bacterias competentes se calcula la eficiencia. Se calculamediante las Unidades Formadoras de Colonias (UFC) por µg de plásmido transformado. Ef= UFC/µg.

DESARROLLO
Nos entregaron 3 tubos con 50µl Bacterias E. Coli competentes cada uno. Las bacterias fueron previamente tratadas con CaCl2. El Ca⁺ neutraliza la repulsión entre la carga negativa de las proteínas de membrana y de los fosfatos de los Ácidos Nucleicos del ADN plasmidico, facilitando laentrada del plasmido a la bacteria.
Se debe mantener a las bacterias en hielo para disminuir su actividad metabolica y enzimatica. Y como las bacterias se encuentran en un estado de competencia, se las debe tratar con cuidado ya que están extremadamente sensibles a golpes o agitación.
Numeramos los tres tubos de bacterias para poder identificarlos. Al Tubo numero 1 le agregamos 5µl de H₂O estéril. Altubo numero 2 le agregamos 5µl un plásmido control con una concentración conocida de 0,5 ng/µl. Y al tubo numero 3 le agregamos 5µl nuestro plásmido preparado en el Trabajo practico 1 con concentración desconocida. A los tubos a los que les agregamos DNA con el gen de resistencia a antibióticos los llamaremos controles positivos, mientras que al que no se le agrego material genético le llamaremoscontrol negativo.
Volvemos a poner las bacterias en hielo ya que a temperaturas bajas la velocidad del movimiento de la membrana plasmática es menor y por lo tanto permite la entrada del DNA plasmidico recién introducido a las soluciones.
Sometemos los tres tubos a un “SHOCK TERMICO” a una temperatura 45ºC durante NO MÁS DE 90 seg, ya que si se lo deja más tiempo es probable que la bacteria...