Transformacion de ADN plasmidico

Trabajo Práctico N°3
Transformación de Escherichia coli con DNA plasmídico

Introducción:
La transformación es la adquisición, por una célula bacteriana, de DNA foráneo proveniente de medioextracelular que puede ser degradado o puede incorporarse al cromosoma por recombinación. En caso de que el DNA sea un plásmido puede quedar como elemento replicativo autónomo dentro de la célula.
Lasbacterias que se encuentran en un estado fisiológico tal que pueden captar DNA foráneo del medio extracelular se las denomina competentes.
Objetivo: Transformar E. coli con el plásmido purificado en eltrabajo práctico “Extracción de DNA plasmídico”.
Materiales y métodos
Cultivo de E. coli competentes
Medio de cultivo LB
Medio de cultivo LB sólido que contiene ampicilina (100 µg/ml)
DNA
Desarrollo:Recibimos tres tubos eppendorf conteniendo cada uno 50 µl de bacterias competentes (fueron numerados del 1 al 3), un tubo con el plásmido control preparado por los docentes y un tubo con el plásmidopreparado por nuestro grupo.
Al tubo número 1 se le agregó 5 µl de agua estéril. (Control negativo)
Al tubo número 2 se le agrego 5 µl de plásmido control cuya concentración es conocida (0,5ng/ml).
Altubo numero 3 le agregamos 5 µl del plásmido purificado, al que se le realizó una dilución previa 1/250.
Colocamos los tres tubos en hielo durante 20 minutos.
Luego durante 90 segundos se los colocoen un baño a 42°C (Shock térmico).
Colocamos los tubos en hielo con agua durante 5 minutos para que se enfríen rápidamente.
Agregamos 950 µl de LB líquido a cada uno de los tubos, homogeneizamos lamuestra y se los dejo incubar por 30 minutos a 37°C en un baño termostático, con agitación ocasional. En estas condiciones las bacterias crecen y se reproducen, recuperándose del Shock.
Plaqueamosaproximadamente 100 µl de la suspensión de bacterias en placas de petri con agar LB sólido con ampicilina (Utilizamos este antibiótico como fuerza selectiva para aislar las bacterias que lograron...