TRIPLEX 1

Protocolo para determinar 3 microsatélites del cromosoma X (reacción triplex: DXS7133, DXS10011 y HPRTB) tomado del proyecto: “Determinación demicrosatélites del cromosoma X: Futura aplicación a la toxicogenómica”

1- Realizar PCR con las siguientes condiciones


Reacción de amplificación para losmicrosatélites: DXS7133, DXS10011 y HPRTB (Volumen final de reacción=6 µL)

Reactivo
Concentración de solución stock
Volumen para 1 reacción
Buffer
10X
0.6 µL
MgCl2
25 mM
0.54 µL
dNTPs
2 mM
0.375 µL
Betaína

1.2 µL
DXS7133 F
10µM
0.3 µL
DXS7133 R
10µM
0.3 µL
DXS10011 F
10µM
0.18 µL
DXS10011 R
10µM0.18 µL
HPRTB F
10µM
0.15 µL
HPRTB R
10µM
0.15 µL
Taq polimerasa

0.06 µL
DNA
10ng/µL
1.5 µL
H2O

1.2 µL

Para una reacción colocar 4.5 µL de la mezcla dereactivos y 1.5 µL de la muestra de DNA.

2- Amplificar los microsatélites en un termociclador con las siguientes condiciones de reacción
TERMOCICLADOR10 CICLOS
20 CICLOS

95°C
94°C
60°C
70°C
90°C
60°C
70°C
60°C
10 min
1 min
1 min
1 min
1 min
1min
1 min
45 min

3. Después de obtener el producto dePCR, analizar los microsatélites por medio de electroforesis capilar
4. Para ello es necesario colocar solución del marcador LIZ-500 diluído en formamidaFormamida (72 µL)
LIZ-500 (3 µL)
5. Colocar en la placa para electroforesis capilar 5 µL de la solución de marcador diluido en formamida y 2 µL deproducto de PCR
6- Analizar los microsatélites en el analizador con el Método de análisis: Microsatellite Default y como size standart: LIZ_3130_NUEVO