p - nitrofenol

Introducción

Este experimento tiene como propósito entender los principios básicos de la espectrofotometría, aprender a utilizar el espectrofotómetro, identificar el pico de absorción de una solución de para-nitrofenol y calcular la concentración de una solución desconocida a partir de una curva de calibración y de la Ley de Beer. La espectofometria es uno de los métodos más usados enel campo de investigaciones biológicas. Se denomina medición de la cantidad de energía radiante que absorbe un sistema químico en función de la longitud de onda de la radiación, y a las mediciones a una determinada longitud de onda (Ing. Carlos Brunatti y Lic. Ana María Martín). Este instrumento permite comparar la radiación absorbida o transmitida por una solución que contiene una cantidaddesconocida de soluto y una cantidad conocida de la misma sustancia ( Juanto 2005). El color de las sustancias se debe a que estas absorben ciertas longitudes de onda de luz blanca que incide sobre ellas, y solo vemos aquellas longitudes de onda que no fueron absorbidas ( Juanto). En otras palabras, el color que vemos no es realmente el color de la sustancia sino es el que es trasmitido, ya que elcolor original fue absorbido por las partículas del mismo. Se medirá la absorbancia de P – nitrofenol y del desconocido que está directamente correlacionada con la concentración de dichas sustancias (Deymer Gómez y Emilson León Florian).


Materiales y métodos

Se calibro el espectrofotómetro con un buffer alcalino pH 9.5 agregando el mismo en la cubeta de cuarzo del espectrofotómetro despuésde limpiarlo con “Kimwipes” y utilizando la función de “example blank”. Luego se midió el P- nitrofenol concentrado en el espectrofotómetro luego de limpiarlo con “Kimwipes” para obtener el pico de absorbancia añadiendo el mismo a la cubeta de cuarzo del espectrofotómetro utilizando la función “Read Sample”. Después se preparó unas diluciones de 1:2 a partir de la solución de P – nitrofenol de100um hasta obtener 6.25um. Para esto se lavaron y secaron cinco tubos de ensayo y se rotularon por orden numérico. Al primer tubo se le virtio 4ml de p – nitrofenol utilizando una pipeta de 10ml con un aspirador de vacio rápido(10ml) y a los otros cuatro dos militros de buffer alcalino pH 9.5 al cual se le utilizo otra pipeta de 10ml. Al segundo tubo se le añadió dos ml de solución del tubo deensayo anterior para esto se utilizó otra pipeta, luego se colocó en el vortex para mezclar la solución. Se repito ese paso hasta el tubo número 5. Se midió la absorbancia de las diluciones desde la menor concentración hasta la mayor concentración de P - nitrofenol utilizando el pico de absorbancia del stock que se utilizó como medida de largo de onda fija. Como último procedimiento se medió lasustancia desconocida.


Resultados
Pico de Absorbancia de p - nitrofenol

















Instrumento
Absorbancia
Pico de
Absorbancia
Largo de onda (nm)
SMART SPEC
402
310-402















Lecturas de absorbancia de p – nitrofenol a diferentes concentraciones







Tubo

Concentración p-nitrofenol
(uM)
Volumenp-nitrofenol
(mL)
Volumen
Buffer alcalino
(mL)
Cálculo
Absorbancia Beckman
1
100
4
0
1.7
1.67
2
50
2
2
0.870
0.824
3
25
2
2
0.425
0.411
4
12.5
2
2
0.213
0.205
5
6.25
2
2
0.106
0.102
Desc.#




0.520
Blanco
0



0















Cálculos
A= E(1)c, E=.017 E= (Y2-Y1)/(X2-X1) c = A/EP1 = (100, 1.67) P2 = (50, 0.824)
E = (0.824-1.67)/(50-100) = 0.017
1) A= (.017)(1)(100) = 1.7
2) A= (.017)(1)(50) = 0.85
3) A= (.017)(1)(25) = 0.425
4) A= (.017)(1)(12.5) =0.213
5) A= (.017)(1)(6.25) = 0.106
Grafica


Concentración de p – nitrofenol en el desconocido
Métodos
Concentración (uM) Excel
Concentración (uM) Manual
Directamente de la Curva de Calibración
30um...