03 A cidos Nucleicos me todos anali ticos

Ácidos
 Nucleicos:
 métodos
 
analí3cos
 

1
 

2
 

Espectrofotometría
 Ultravioleta
 
•  Es
 una
 de
 las
 técnicas
 más
 u3lizadas
 debido
 a
 su
 sencillez,
 
precisión,
 rapidez.
 
•  Se
 basa
 en
 la
 capacidad
 de
 absorción
 de
 energía
 electromagné3ca
 
que
 3enen
 las
 sustancias
 (cromóforos).
 
•  Las
 bases nitrogenadas
 (planas,
 aromá3cas
 y
 asimétricas)
 son
 los
 
cromóforos
 más
 significa3vos
 que
 contribuyen
 al
 espectro
 de
 
absorción
 ultravioleta
 de
 los
 á.
 n.
 
 (con
 un
 máximo
 a
 260nm).
 
•  Se
 u3liza
 para
 la
 detección,
 cuan3ficación
 y
 el
 análisis
 de
 pureza
 
de
 las
 soluciones
 con ácidos
 nucleicos.
 
3
 

4
 

5
 

Ley
 de
 Lambert-­‐Beer
 
Existe una proporcionalidad entre la absorbancia, la concentración molar del
cromóforo.
 

A=εcl
 

L
 

ε: coeficiente de extinción molar (constante de proporcionalidad)
C: concentración
L: longitud en cm de la longitud atravesada por la radiación
 

 

Cuando l=1 a la absorbancia se le
llama, Densidadóptica (DO) y es
directamente proporcional a la
concentración de la sustancia.
 

DO=εc
 
6
 

Las
 bases
 nitrogenadas
 son
 :
 
•  Principal
 agente
 cromóforo
 del
 ADN.
 
•  Más
 expuestas
 en
 el
 ssDNA
 (o
 RNA)
 que
 en
 el
 dsDNA,
 
por
 lo
 que
 absorben
 más
 radiación.
 

εRNA≈εssDNA>εdsDNA




DO=εc
 

1 unidad de DO a 260nmen una solución pura de ARN o ssDNA 40mg/ml
1 unidad de DO a 260 nm en una solución pura de dsDNA equivale a 50mg/ml


Consideraciones:
 
•  Estas
 relaciones
 sólo
 se
 man3ene
 si
 las
 soluciones
 son
 puras,
 una
 mezcla
 de
 
ARN
 y
 ADN
 tendrá
 un
 valor
 intermedio.
 
 
•  La
 absorbancia
 a
 260
 nm
 no
 permite
 dis3nguir entre
 el
 ARN
 y
 el
 ADN.
 
•  La
 absorbancia
 del
 ADN
 varía
 con
 la
 temperatura.
 

7
 

ssDNA
 

dsDNA
 

La
 DO
 del
 ADN
 varía
 con
 la
 
temperatura:
 La
 temperatura
 
desnaturaliza
 las
 moléculas
 de
 
ADN,
 que
 pasan
 a
 ser
 de
 cadena
 
simple
 y
 a
 absorber
 más
 radiación.
 
 

8
 Las
 proteínas
 3enen
 también
 
cromóforos
 

tryptophan

 

 


 

 
 


 


 


 


 


 tyrosine
 

Las
 proteínas
 presentan
 también
 cromóforos,
 principalmente
 
triptófano
 y
 la
 3rosina,
 que
 contribuyen
 a
 que
 tengan
 un
 
espectro
 de
 absorción
 con
 un
 máximo
 a
 280nm
 
 
 

9
 Espectrofotometría
 UV
 de
 proteínas
 

(fenil
 alanina)
 
10
 

11
 

Detección
 de
 contaminantes
 en
 la
 purificación
 
de
 ADN
 mediante
 espectrofotometría
 
•  El
 ácido
 nucleico
 puro
 no
 3ene
 casi
 ninguna
 absorbancia
 a
 
300
 nm,
 y
 bastante
 baja
 absorbancia
 a
 280
 nm.
 
•  La
 pureza
 de
 una preparación
 de
 ácido
 nucleico
 puede
 
es3marse
 a
 par3r
 de
 la
 forma
 los
 espectros
 de
 
absorbancia.
 

 
Para
 comprobar
 la
 pureza
 de
 la
 solución
 tradicionalmente
 se
 
suele
 medir
 los
 ra3os:
 el
 ra3o
 
• 
 A260nm
 /A280nm
 
• 
 A260nm
 /A230nm
 

 
12
 

Ra3o
 A260nm
 /A280nm
 
 
Para
 una solución
 Pura
 de
 ADN:
 1.8-­‐1.9
 
Para
 una
 solución
 Pura
 de
 ARN:
 1.9-­‐2.1
 
Las
 cinco
 bases
 nitrogenadas
 3enen
 
diferentes
 ra3os
 A260nm
 /A280nm:
 

Guanine:
 1.15
 
 
Adenine:
 4.50
 
Cytosine:
 1.51
 
 
Uracil:
 4.00
 
 
Thymine:
 1.47
 

El
 ARN
 3ene
 un
 ra3o
 A260nm
 /A280nm
 ligeramente...