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LABORATORIO N°1
ESPECTROFOTOMETRIA: CUANTIFICACION DE PROTEINAS






Alumnos:

Objetivos principales y específicos

El objetivo principal de este práctico es cuantificar proteínas mediante análisis espectrofotométrico, y a través de éstedesignamos nuestros objetivos específicos que son:
Cuantificar proteínas a través del Método de Bradford y el Método de Lowry
Utilizar el espectrofotómetro para obtener la absorbancia de las sustancias a medir.
Realizar la curva de calibración para ambos métodos. En el caso de que la curva de calibración nos de una línea recta, el experimento estará bien hecho cumpliendo con la ley deLambert-Beer.




























Introducción

El espectrofotómetro es un instrumento que permite comparar la radiación absorbida o transmitida por una solución que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de concentración que se denomina “patrón o estándar”.
La espectrofotometría se utiliza para cuantificar eidentificar sustancias mediante espectros de absorción (visible / ultra violeta). Permite conocer la concentración de alguna solución, como por ejemplo, proteínas, glucosa, entre otras.
Para analizar los resultados que nos entrega el espectrofotómetro utilizaremos una solución blanco que contiene todos los componentes del sistema, menos el que se desea medir.
En este práctico compararemos laabsorbancia de una sustancia cuya concentración es desconocida mediante dos métodos: Lowry y Bradford.
El método de Lowry consiste en añadir un reactivo que forma un complejo coloreado con las proteínas.
Este método consta de dos etapas:
1.- Los iones de cobre, en medio alcalino, se unen a las proteínas formando complejos con los átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos. Estos complejoscobre-proteínas tienen un color azul claro. Además, provocan el desdoblamiento de la estructura de la proteína, exponiendo los residuos de tirosina y triptófano que participan en la segunda etapa de la reacción.
2.- Al reducirse la muestra, se le añade el reactivo Folin-Ciocalteau. Si existen proteínas, se produce una coloración azul intensa por la presencia de los residuos de tirosina y triptófano,midiéndose la absorbancia a 650 nm para ser comparada con las medidas obtenidas de las soluciones patrón.
El método de Bradford se basa en la unión de un colorante (azul de comassie G-250) a las proteínas. El colorante, al unirse con las proteínas nos entrega un cambio de color, principalmente azul. Este método es muy sensible y pocas sustancias interfieren en su determinación. Una de susdesventajas es que el colorante utilizado no se fija en todas las proteínas por igual provocando resultados poco homogéneos.



Cálculos y Resultados

Método de Bradford
En este método utilizamos una batería de tubos de ensayo enumerados. Designamos el número uno a la solución blanco; del número 2 hasta el 6, las soluciones y los tubos 7 - 8, las muestras problemas. Posteriormente agregamoslos volúmenes de solución seroalbúmina de bovino (BSA), agua y Reactivo de Bradford en cada uno de los tubos con las cantidades establecidas en la tabla 1. Al tener las mezclas listas en cada tubo, esperamos cinco minutos exactos para luego leer en el espectrofotómetro a 590 nm, calibrado previamente con la solución blanco.
Para calcular la concentración del tubo de ensayo n°2, realizamos lossiguientes pasos:

1. Transformación de unidades (de µl a ml)
1000 µl = 1 ml
20 µl = x ml
x = 0.02 ml


2. Calcular la masa (mg)
10 mg = 1 ml
x mg = 0.02 ml
x = 0.2 mg


3. Calcular la concentración (mg/ml)

20 µl + 80 µl + 3 ml = 3.1 ml...