Biotecnologia

Pràctiques de Proteòmica.
2n Quadrimestre 3er curs. Titulació de Biotecnologia. Universitat de Lleida L’objectiu de la pràctica es la caracterització del proteoma de la llet humana i de fórmula infantil. Per tal de dur-la a terme es separaran les proteïnes presents en un extret cru de cèl·lules d’aquest bacteri mitjançant electroforesis bidimensional i alguns dels spots presents en el gels’identificaran mitjançant empremta peptídica utilitzant MALDI-TOF.

Dia 1, dilluns: Preparació de la mostra i els gels de la segona dimensió. Inici de la primera dimensió (3 hores) Pas 1: preparació de la mostra - Ficar 10 μl de llet en un eppendorf i afegir-hi 90 μl d’acetona freda. - Incubeu el tub en gel durant 10 minuts. Això provocarà la precipitació de les proteïnes presents en la beguda -Centrifugueu el tub durant 5 minuts. Les proteïnes es queden en el pellet. -Eliminar el SN i afegir 50 μl d’acetona freda. Vortexar durant 10 segons i tornar a centrifugar. - Eliminar el SN i deixar assecar el pellet durant 2 minuts. - Resuspendre el pellet cellular amb 175 µl de RHB pipetejant amb MOLTA cura fins que el pellet s’hagi disolt. - Sonicar el tub al bany d’ultrasons durant 3 minuts. -Deixar reposar a temperatura ambient durant 2h. Pas 2: preparació dels gels de SDS-PAGE - Montar els vidres al seu soport. - Comprovar la estanqueitat dels vidres afegint aigua destil·lada. - Eliminar l’aigua i assecar els vidres amb tires de paper de filtre. - Afegir 4 ul TEMED a la barreja de gel separador (4.5 ml), remenar i afegir la solució entre els dos vidres - Cobrir el gel amb 2 X 100 µld’aigua - Deixar polimeritzar durant 10 minuts - Eliminar l’aigua amb un paper de filtre - Afegir 4 ul TEMED a gel concentrador (1 ml), remenar i afegir solució entre els dos vidres. Tot seguit colocar la pinta a la part superior.

1

- Deixar polimeritzar

Pas 3: primera dimensió - Centrifugar l’extret cel·lular preparat en el pas 1 durant 5 minuts. Transferir el SN a un eppendorf nou. - Colocar150 ul de la mostra (SN) en electrode tray - Extraure el plàstic de la tira IPG i colocar-la cara avall sobre la mostra en electrode tray - Recobrir la tira amb 0.75 ml d’Oli Mineral. - Iniciar cursa segons el següent gradient: Rehidratació: Activa (50V) 15 hores Step 1: de 50V a 4000 V Increment ràpid. Fins 20000 V·hora. Step 2: de 4000 V fins 500 en 1 hora. Descens lineal. Step 3: standby, 500 VDia 2 (dimarts) Segona dimensió, tinció i inici de la digestió de les mostres (4 hores) Segona dimesió - Treure poc a poc el comb dels gels de poliacrilamida. Netejar els pous amb una mica d’aigua destil·lada. Eliminar-la amb paper de filtre. - Montar els gels a les cubetes d’electroforesis. - Treure les tires IPG de l’electrode tray. Eliminar amb cura les restes d’oli mineral i introduir-les enels tubs de plàstic de 10 ml. - Afegir 1 ml de solució d’equilibrat al tub. Incubar la tira durant 10 minuts agitant suaument. - Extreure la tira del tub amb unes pinces i tallar amb unes tisores l’extrem bàsic. - Disposar la tira sobre el gel. - Afegir running buffer - Afegir 3 µl de marcador de pes molecular al pou corresponent - Còrrer els gels a amperatge constant (40 mA/gel) - Un cop el fronthagi arribat al final del gel, aturar la cursa, extreure els gels i posar-los en aigua destillada. - Fer tres rentats de 5 minuts de durada cadascun amb aigua destil·lada. - Tenyir el gel amb 25 ml de EZBlue Gel Staining Reagent durant 45 minuts. - Mentre dura la tinció netejar amb cura els vidres i les cubetes d’electroforesis.

2

- Visualitzar les proteïnes separades en els gels.Digestió de les mostres amb tripsina Seleccionar un spot i retallar-lo amb l’ajuda d’una punta groga prèviament escapçada. Dipositar-lo en un tub eppendorf. Afegir al tub 500 µl d’aigua destil·lada . Esperar 5 minuts i extreure-la Afegir al tub 500 µl de bicarbonat amònic 25 mM (ABC). Esperar 5 minuts i extreure’l. Afegir al tub 500 µl d’ABC 12.5 mM/50% acetonitril (ACN). Esperar 5 minuts i...