Ensayo Practico De Enzimatologia

CARRERA DE TECNOLOGÍA MÉDICA
LABORATORIO DE BIOLOGÍA CELULAR
PROFESOR IRVING DOLL

INFORME DE LABORATORIO DE ENZIMATOLOGÍA
Introducción
Una enzima se caracteriza por tener la capacidad de disminuir la energía de activación (que es la barrera energética a vencer por los reactivos para transformarse en productos), es decir, acelera la reacción y por ende favorece la transformación deproductos. Son altamente específicas, ya que poseen un sitio activo específico para cada sustrato. Se debe tener en cuenta que la enzima o catalizador, no alteran ni modifica el balance energético en las reacciones que intervienen, por lo que el equilibrio permanece constante.
Entonces, una reacción enzimática es aquel proceso biológico que tiene lugar en una enzima. Cabe destacar que la granmayoría de los procesos celulares esta mediado por enzimas, desde la duplicación del ADN, la reproducción celular, la asimilación y desecho de sustancias, la concentración de sustancias dentro de las células, entre otras.
El trabajo practico N° 5 consiste en determinar la actividad del sistema enzimático glucosa oxidasa-peroxidasa.
La Glucosa-oxidasa es una enzima que cataliza la oxidación de laglucosa para formar peróxido de hidrogeno y acido glucónico, esta reacción se acopla a una peroxidasa, produciendo una muestra coloreada, cuya intensidad de color es directamente proporcional a la concentración de la glucosa en la muestra
Descripción de la actividad

En el siguiente procedimiento se explicará la secuencia de la reacción enzimática de la glucosa, para lo cuál se utilizarán 2grupos con 3 muestras en cada uno, los que posteriormente se harán reaccionar a la luz monocromática, y se obtendrán así los valores de transmisión y absorción de la luz en cada una de las muestras. Entonces se podrá realizar una comparación entre una muestra normal y una muestra alterada en este caso, por la T°.

Materiales

* Espectrofotómetro: Este instrumento nos permite medir elcomportamiento de una molécula en una solución, al reaccionar a una leve luz monocromática. Se realiza mediante la emisión de una luz blanca que pasa por un filtro monocromador. Esto nos permite detectar el porcentaje de transmitancia y porcentaje de absorbancia.
Porcentaje de transmitancia: Se refiere a la luz que se transmitió a través de la muestra.
Porcentaje de absorbancia: Se refiere a lacantidad de luz absorbida por la muestra.

6 Tubos de ensayo
1 Micropipeta de 100-1000µL
1 Micropipeta de 10-100µL
Set de puntas desechables de plástico para ambas micropipetas
Gradilla 
Calentador
Solución desconocida
Glucosa

Reactivos:
-Buffer fosfato pH 7,4……………….100 mM
-Glucosa oxidasa…………………….>15 U/mL
-Peroxidasa…………………………...>2 U/mL-4-aminoantipirina…………………….0,5 mM
-Ácido p-hidroxibenzoico…………….10 mM
-Ázida sódica…………………………..0,1 g/dL

Método empleado y procedimiento
Se tienen a disposición 2 muestras, cada una con 3 tubos de ensayos, y que estarán conformados de la siguiente manera:
* Tubo n°1: Blanco
* Tubo n°2: Estándar
* Tubo n°3: Muestra problema
Primera reacción:
Con una propipeta se mide 1 mL de reactivo y se agrega a los tres tubos enigual cantidad.
Al tubo estándar, se le adicionan 10µl de glucosa y a la muestra problema, 10 µl de sustancia desconocida. Por lo que quedarán conformados de la siguiente manera:
* Tubo n°1: Blanco
* Tubo n°2: Estándar + 10 µl de glucosa
* Tubo n°3: Muestra problema + 10 µl de sustancia desconocida
Luego de agitarlos durante unos segundos, se puede observar que rápidamente eltubo estándar comienza a cambiar a un color rosáceo. La muestra problema, en cambio, tarda un poco mas, cambiando paulatinamente a una tonalidad rojiza.
Observado el cambio de color entonces podemos decir que efectivamente estamos en presencia de glucosa en las muestras, y que ésta ha reaccionado con el reactivo enzimático glucosa-oxidasa.
Entonces se deja reposar las muestras...