FACSibt
Páginas: 20 (4898 palabras)
Publicado: 10 de noviembre de 2015
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA
Citometría de flujo: Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)
Milena Salgado Lynn
Curso de Métodos en Biotecnología
Semestre 2002-2
Coordinador: Dr. Roberto Stock
27 de mayo de 2002
Índice
Página
Introducción
3
Historia del Instrumento
5
Descripción y funciones de los componentes del aparato
Sistema de Flujo
7Sistema Óptico
7
Sistema Eléctrico
8
Obtención de los datos e interpretación
10
Aplicaciones
12
Bibliografía
18
2
Introducción
Actualmente, la mayoría de las preguntas en el campo de la biología celular se enfocan en
saber qué es lo que sucede con las células integrantes de un sistema, cómo son las
interacciones dentro del mismo y, sobre todo, cuáles son las propiedades individuales decada una.
Estas preguntas han llevado a la necesidad de aislar y/o purificar
subpoblaciones y subcomponentes celulares, generalmente para (1) enriquecer poblaciones o
para (2) eliminarlas. Para alcanzar estos objetivos, el primer paso en el proceso de
aislamiento es la identificación y clasificación de las células. La clasificación de las
células puede basarse en propiedades fisicoquímicas,inmunológicas y funcionales. Los
métodos de clasificación que se basan en propiedades funcionales utilizan características
tales como afinidad, adherencia o crecimiento. La clasificación inmunológica se basa en la
utilización de anticuerpos dirigidos contra epítopes celulares.
En la práctica, las
características fisicoquímicas son las más utilizadas para la separación o “sorteo celular”;
se incluyencaracterísticas como tamaño, volumen, densidad, propiedades de dispersión de
la luz, potencial de membrana, pH, carga eléctrica y contenido celular de diferentes
compuestos como ácidos nucléicos, enzimas y otras proteínas (Orfao, et.al.; 1996).
En los últimos años ha habido un incremento en las técnicas que utilizan más de una
característica celular para clasificar y separar diferentessubconjuntos celulares y
componentes subcelulares. Estas técnicas pueden agruparse básicamente en (a) separación
gruesa y (b) separación de células individuales. La separación gruesa se refiere a métodos
tales como la filtración celular, la centrifugación o sedimentación y el cultivo celular. La
separación de células individuales se refiere principalmente a la citometría de flujo que,
enriquecida con el“sorteo celular”, es la mejor técnica para proveer información en cuanto al
análisis y separación de poblaciones celulares.
La citometría de flujo es un proceso que permite que las células (500 – 4000/ seg) pasen en
fila dentro de un flujo a través del aparato (Beckton Dickinson Immunocytometry
Systems; 1995). Mientras esto sucede, se puede hacer la medición simultánea de múltiples
característicasfísicas de una sóla célula. La ventaja analítica de la citometría de flujo tiene
3
como base la habilidad de hacer mediciones cuantitativas y multiparamétricas en un
número estadísticamente adecuado de células para definir las propiedades de una población
celular o de las subpoblaciones que la componen. El análisis multiparamétrico hace posible
evaluar poblaciones celulares particulares dentro deuna mezcla compleja, ya que aprovecha
propiedades intrínsecas de la célula como la dispersión de la luz, y características
controladas como la fluorescencia. Al mismo tiempo, es posible separar las poblaciones
definidas por éste análisis (Parks D.R., et.al.; 1984). Estas ideas son la base de la técnica
conocida como FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting).
El FACS proporciona datos tales como eltamaño relativo de la célula, granularidad o
complejidad interna y la intensidad relativa de fluorescencia. Para llevar a cabo lo anterior,
el aparato necesita (como cualquier citómetro de flujo) de un sistema combinado de flujo,
óptica y electrónica (Figura 1). El sistema de flujo introduce y restringe a las células para
su análisis individual, el sistema óptico excita la muestra y colecta...
INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA
Citometría de flujo: Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)
Milena Salgado Lynn
Curso de Métodos en Biotecnología
Semestre 2002-2
Coordinador: Dr. Roberto Stock
27 de mayo de 2002
Índice
Página
Introducción
3
Historia del Instrumento
5
Descripción y funciones de los componentes del aparato
Sistema de Flujo
7Sistema Óptico
7
Sistema Eléctrico
8
Obtención de los datos e interpretación
10
Aplicaciones
12
Bibliografía
18
2
Introducción
Actualmente, la mayoría de las preguntas en el campo de la biología celular se enfocan en
saber qué es lo que sucede con las células integrantes de un sistema, cómo son las
interacciones dentro del mismo y, sobre todo, cuáles son las propiedades individuales decada una.
Estas preguntas han llevado a la necesidad de aislar y/o purificar
subpoblaciones y subcomponentes celulares, generalmente para (1) enriquecer poblaciones o
para (2) eliminarlas. Para alcanzar estos objetivos, el primer paso en el proceso de
aislamiento es la identificación y clasificación de las células. La clasificación de las
células puede basarse en propiedades fisicoquímicas,inmunológicas y funcionales. Los
métodos de clasificación que se basan en propiedades funcionales utilizan características
tales como afinidad, adherencia o crecimiento. La clasificación inmunológica se basa en la
utilización de anticuerpos dirigidos contra epítopes celulares.
En la práctica, las
características fisicoquímicas son las más utilizadas para la separación o “sorteo celular”;
se incluyencaracterísticas como tamaño, volumen, densidad, propiedades de dispersión de
la luz, potencial de membrana, pH, carga eléctrica y contenido celular de diferentes
compuestos como ácidos nucléicos, enzimas y otras proteínas (Orfao, et.al.; 1996).
En los últimos años ha habido un incremento en las técnicas que utilizan más de una
característica celular para clasificar y separar diferentessubconjuntos celulares y
componentes subcelulares. Estas técnicas pueden agruparse básicamente en (a) separación
gruesa y (b) separación de células individuales. La separación gruesa se refiere a métodos
tales como la filtración celular, la centrifugación o sedimentación y el cultivo celular. La
separación de células individuales se refiere principalmente a la citometría de flujo que,
enriquecida con el“sorteo celular”, es la mejor técnica para proveer información en cuanto al
análisis y separación de poblaciones celulares.
La citometría de flujo es un proceso que permite que las células (500 – 4000/ seg) pasen en
fila dentro de un flujo a través del aparato (Beckton Dickinson Immunocytometry
Systems; 1995). Mientras esto sucede, se puede hacer la medición simultánea de múltiples
característicasfísicas de una sóla célula. La ventaja analítica de la citometría de flujo tiene
3
como base la habilidad de hacer mediciones cuantitativas y multiparamétricas en un
número estadísticamente adecuado de células para definir las propiedades de una población
celular o de las subpoblaciones que la componen. El análisis multiparamétrico hace posible
evaluar poblaciones celulares particulares dentro deuna mezcla compleja, ya que aprovecha
propiedades intrínsecas de la célula como la dispersión de la luz, y características
controladas como la fluorescencia. Al mismo tiempo, es posible separar las poblaciones
definidas por éste análisis (Parks D.R., et.al.; 1984). Estas ideas son la base de la técnica
conocida como FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting).
El FACS proporciona datos tales como eltamaño relativo de la célula, granularidad o
complejidad interna y la intensidad relativa de fluorescencia. Para llevar a cabo lo anterior,
el aparato necesita (como cualquier citómetro de flujo) de un sistema combinado de flujo,
óptica y electrónica (Figura 1). El sistema de flujo introduce y restringe a las células para
su análisis individual, el sistema óptico excita la muestra y colecta...
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