FUNDAMENTOS Protocolo DNA y RNA



Fundamentos Protocolo Extracción DNA


Los protocolos de extracción de ácidos nucleicos se basan en tres grandes etapas,
1) Rompimiento de paredes y membranas: Esto lo logramos con un buffer de extracción. El cual contiene cualquier detergente siendo el más común SDS, un agente quelante, en algunos casos un agente reductor para taninos y otros contaminantes, a veces una proteinasa(proteinasa K) y un reactivo cuya función erá mantener el pH estable (Tris).
2) Purificación de ácidos nucleicos: se logra separando el ácido nucleico de proteínas, aprovechando la polaridad de los ácidos nucleicos y la no polaridad de las proteínas. Para esto se usa fenol o fenol cloroformo seguido de lavados con cloroformo-isoamil.
3) Precipitación y resuspensión: Esto se logra con sales y alcoholes. Lassales vuelven el ADN con carga total neutra y el etanol ayudará a que precipiten los ácidos nucleicos (ver a continuación).

Las diferencias entre extracciones de ADN y ARN radican principalmente en tratar de limpiar el DNA lo que se logra con una DNasa al final del protocolo o con un fenol ácido (ver documento anexo). La precipitación en el caso de RNA se hace con LiCl y las soluciones deben serpreparadas o agua tratada con DEPC (diethyl pirocarbonato) que denatura enzimas.

Buffer de extracción:
EDTA: El EDTA es un agente quelante con alta afinidad por metales. En este caso como se rompen las células el DNA queda expuesto a las DNAsas las cuales usan Mg2+ como cofactor. El EDTA actúa en el proceso de lisis quelando el catión Mg2+ impidiendo así la función de las DNAsas. Adicionalmenteel EDTA promueve la disrupción de la membrana.
Tris: El DNA es sensible a cambios de pH, como en el proceso de extracción se liberan proteínas, RNA, etc., esto puede tener un impacto en el pH y por lo tanto en el DNA. El Tris actúa como buffer manteniendo el pH constante (pH 8.0), evitando así cualquier tipo de daño al DNA.
NaCl: El NaCl reduce la solubilidad de las proteínas haciendo que éstas seprecipiten. De igual manera el NaCl interactúa con el DNA neutralizando las cargas bajando así su solubilidad pero no tanto como para precipitarlo. Esto se debe a la constante dieléctrica del agua que no permite una interacción entre los iones Na+ y el ion PO3- del DNA.
β-Mercaptoetanol: Es un agente reductor fuerte el cual puede remover taninos y otros polifenoles que puedan estar presentes enla muestra.
SDS: El SDS es el detergente que permite la solubilización de proteínas y lípidos que hacen parte de la membrana. Adicionalmente, el SDS ayuda a la remoción de proteínas asociadas al DNA denaturándolas.

Acetato de Potasio:
En adición al NaCl, el acetato de potasio ayuda también a la precipitación de proteínas y otros restos celulares. Sin embargo el acetato también permite laprecipitación del SDS y las proteínas que se asociaron a éste último. De igual manera, el acetato de potasio baja la solubilidad del DNA para el próximo paso de precipitación del mismo.

Isopropanol:
Al contrario del agua, el isopropanol tiene una constante dieléctrica menor lo que permite una mayor interacción del Na+ y el PO3- del DNA reduciendo drásticamente su solubilidad haciendo muy fácil suprecipitación una vez centrifugado. La temperatura en este paso permite una mejor floculación del DNA lo que facilita la formación del pellet. Por otro lado, el isopropanol tiene una clara ventaja sobre el etanol y es que es menos polar por su estructura química, tres carbonos en vez de dos. Por eso es más eficiente la precipitación con isopropanol que con etanol pero el problema es que pos suscaracterísticas va a precipitar sales por lo cual la precipitación con etanol se hace en menos tiempo, menos cantidad de isopropanol y a temperatura ambiente.

Buffer TE:
Una vez resuspendido el DNA en el buffer, este sirve de nuevo para mantener el pH y proteger el DNA de las DNAsas. Adicionalmente, la concentración de sales se eliminó al descartar el isopropanol, y si quedaron rastros se diluyen con el...