Informe pcr

Pontificia Universidad Católica de Chile
Facultad de Ciencias Biológicas
Laboratorio de bioquímica y biología celular

















Práctico Nº9:
“Amplificación de DNA por PCR”




Integrantes: Francisco Morales
Susana Tapia
Paulina Troncoso


Introducción

En el estudio del DNA, se vuelve imperante la utilización de distintas técnicas que nospermitan amplificar una secuencia muestral y que además nos permitan cuantificar la cantidad de DNA en nuestras muestras. Existe una técnica que nos permite (utilizando ciertas variaciones) obtener ambos resultados luego del tratamiento de nuestra muestra. Esta técnica se conoce como PCR.

La PCR (o reacción en cadena de la polimerasa) nos permite amplificar DNA utilizando oligonucleótidossintéticos (primers) los cuales son complementarios a los extremos de cada hebra de DNA en la zona opuesta a la región a amplificar, y son utilizados como partidores para la síntesis de DNA in vitro [0]. Esta síntesis es catalizada por una enzima polimerasa aislada (en este caso) de una bacteria termófila, por lo cual es estable a altas temperaturas (las cuales definen las distintas etapas en cada ciclode amplificación) permitiendo una mayor obtención de DNA en base a una mezcla de reacción que con cualquier otra enzima. Esta mezcla de reacción contiene DNA a amplificar, los 2 primers, DNA-Taq polimerasa y cuatro desoxiribonucleotidos trifosfatos (dNTP) necesarios para la síntesis de DNA.

Centrándonos en la amplificación, vemos que principalmente consta de 20 a 30 ciclos, realizados en untermociclador, en donde se generan distintos cambios de temperatura las cuales definen cada paso en el cual se encuentra el PCR. Los principales pasos a seguir en un ciclo del PCR son los siguientes:

1. Desnaturalización: 95°C, ocurre la separación de las dos cadenas molde
2. Hibridación (o amplificación): 60°C, reducción de temperatura permite el apareamiento de bases de ambos primes en el sitiodonde encuentran una secuencia complementaria
3. Elongación: 72°C, la DNA-Taq Polimerasa replica las hebras de DNA desde el extremo 3’ del primer correspondiente.

Lo anterior es solo para amplificar DNA, pero si queremos cuantificar ácidos nucleicos podemos utilizar una aplicación del PCR llamado PCR-MIMICS. Esta aplicación se basa en el uso de un competidor interno (con respecto a launión de primers, debido a que comparten la misma secuencia de reconocimiento con el DNA de la muestra) de concentración conocida en la reacción del PCR.

La idea consiste en que con distintas concentraciones conocidas del DNA-MIMIC agregadas al mismo volumen fijo de DNA-muestra generarán distintos productos en el PCR, los cuales podrán ser visualizados luego de fraccionarlos en un gel de agarosa.Con esto, por cuantificación en base a desintometría (pixeles) se construye un gráfico (mostrado más adelante en nuestro informe) el cual nos permitirá inferir nuestra concentración de DNA en la muestra.





Materiales

Muestra Madre o MIX

TABLA Nº1
Componente
Volumen Total (µl) 7 tubos
Volumen en cada tubo (µl)
Buffer PCR 10x
17.5 µL
2,5 µL
d NTPs
14 µL
2 µL
primer R 548R14 µL
2 µL
primer F 531F
14 µL
2 µL
MgCl2
17.5 µL
2,5 µL
H2O estéril
80.5 µL
11,5 µL
TOTAL
157.5 µL
22.5 µL

Diluciones
DNA mimic 15mg/ml → 1/1
1/50
1/100
1/200

Componentes a agregar a cada tubo eppendorft para PCR
22.5 µL de Mix
1 µL de DNA Nurr1 Al tubo control negativo estos
1 µL dilución DNA mimic componentes son reemplazados por 2 µLde H₂O
0.5 µL Taq (Proporcionado por la ayudante)

Instrumentos
Sistema de electroforesis en gel de agarosa 0.7%
Termociclador
Software ImageJ
Centrífuga
Micropipeta Gilson P1000
Micropipeta Gilson P200
Micropipeta Gilson P20
Micropipeta Gilson P2
Eppendorft para PCR estériles











Métodos

1. Para empezar comenzamos realizando una muestra madre o mix (los...