Introducción Al Diseño “In Silico” De Primers

Introducción al diseño “in silico” de primers.
Introducción
Esta guía es una aproximación, más o menos detallada, al diseño de primers por medios
informáticos. En la primera parte revisaremos algunos conceptos generales pertinentes a este tema.
En la segunda parte encontrará un taller que le permitirá poner en práctica la mayoría de los
conceptos revisados.
Para una revisión delprocedimiento de PCR consulte los siguientes enlaces:
http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/pcr.html
http://ls126.molsci.org/PCR_primers.html

PARTE I
Hibridación, anillamiento y temperatura de fusión.
Con el término hibridación hacemos referencia a la asociación específica y complementaria de dos
cadenas sencillas de ácidos nucleicos. Esta asociación responde a un proceso físico (al que nosreferimos como “anillamiento”) en el cual las dos cadenas sencillas forman enlaces de hidrógeno
entre sus bases complementarias (A-T y G-C), y de esta manera se lleva la formación de una
molécula de doble cadena, helicoidal y complementaria.
Resulta aparente que para llevar a cabo un proceso de anillamiento es necesario entonces contar con
DNA de cadena sencilla, estado que regularmente debemosinducir en el laboratorio (¡a menos que
estemos trabajando con virus de RNA!) mediante el calentamiento de la cadena doble de DNA por
encima de su temperatura de fusión (melting temperature o Tm) e inmediatamente enfriando la
reacción alrededor de los 0oC. De esta manera se asegura que las hebras recién separadas no
vuelvan a anillarse.
La temperatura de fusión de una molécula dada dependeprincipalmente de su contenido de G+C,
de sí se trata de DNA o RNA, híbridos RNA:RNA (que tienen las temperaturas más altas), de las
condiciones físico químicas de la solución en la que se trabaja, así como de la longitud de las
secuencias implicadas en el proceso (a menor longitud, menor temperatura de fusión).

La longitud de la secuencias es fundamental para su asociación
La asociación de cadenasde ácidos nucléicos mayores de 16pb es un proceso extremadamente
específico. Si tenemos en cuenta las posibilidades combinatorias de diversas “secuencias sonda”
dada una cadena de DNA:
Sonda

Probabilidad

A, C , G o T/U

1/4

Dinucleótido (ej. AG)

1/16

Tetranucleótido (ej. AGCT)

1/256

De esta manera la probabilidad de encontrar una sonda de 16pb es de 1/4'294.967.296.Consideraciones generales para el diseño de primers
Temperatura de anillamiento (Ta)
Como se mencionó anteriormente la temperatura de fusión de una cadena doble de ácidos nucléicos
está relacionada con su longitud y contenido de G+C1. De esta manera la temperatura de
anillamiento que se escoge para una PCR depende directamente de la longitud y composición de
los primers. Es común utilizartemperaturas de anillamiento 5oC por debajo de la temperatura de
fusión más baja del par de primers utilizados (Innis and Gelfand, 1990).
Es importante tener en cuenta que una Ta demasiado baja puede llevar a eventos de inespecificidad
de los primers utilizados, de tal manera que lleguen a ser anillados en secuencias diferentes a la que
queremos amplificar (Rychlik et al., 1990). Una Ta demasiadoalta, por su parte, puede llevar a
que el rendimiento de la amplificación sea muy bajo ya que se reduce la probabilidad de
anillamiento (figura 1). Es muy importante tener consideración también que el par de primers
escogidos deben no tener Tas demasiado diferentes, ya que es muy probable obtener
amplificaciones asimétricas (amplificaciones de una sola hebra).
Fig. 1. Efecto de Ta en laespecificidad y rendimiento de amplificación de papillomavirus humano tipo 16 (HPV 16).

Se amplificaron plantillas de DNA de plasmido y biopsia a diferentes Tas. Notar que el DNA de HPV amplifica específicamente a
50oC. Imagen tomada de: Williamson and Rybicki, 1991: J Med Virol 33: 165-171

Longitud del primer
Un primer debe ser lo suficientemente complejo de tal manera que la probabilidad...