Metodosa de transferencia en la biologia molecular

1. METODOS DE TRANSFERENCIA

WESTERN BLOT
El Western blot (o inmunoblot) es una técnica analítica usada para detectar proteínas específicas en una muestra determinada (que puede consistir en una mezcla compleja de proteínas, como un extracto tisular). Mediante una electroforesis en gel se separan las proteínas atendiendo al criterio que se desee (peso molecular, estructura, hidrofobicidad...casi tantas posibilidades como tipos de electroforesis existen). Luego son transferidas a una membrana adsorbente (típicamente de nitrocelulosa o de PVDF) para poder buscar la susodicha proteína al incubarla con anticuerpos específicos contra ella. La unión puede detectarse por actividad enzimática, fluorescencia. De esta forma se puede estudiar la presencia de proteína en el extracto y analizar sucantidad relativa respecto a otras proteínas.
Esta técnica es hoy en día imprescindible en varios campos de la biología, como la biología molecular, la bioquímica, la biotecnología o la inmunología. Existen numerosas casas comerciales especializadas en la venta de anticuerpos (monoclonales y policlonales) contra decenas de miles de proteínas diferentes.
Pasos del Western blot:
Preparación deltejido
Las muestras pueden ser tomadas de un tejido entero o de un cultivo celular:
• Una pequeña cantidad del tejido introduce en un buffer de extracción. Después, se procede a homogeneizarlos, con una licuadora (para grandes volúmenes de muestra), con un homogenizador (para muestras pequeñas), o por sonicación. Suele hacerse a bajas temperaturas para evitar la desnaturalización proteica.Luego se centrifuga, obteniendo en el sobrenadante las proteínas.[6]
• Las células pueden lisarse por uno de esos métodos mecánicos. También pueden usarse detergentes, sales o tampones que favorezcan la lisis y solubilicen las proteínas. A veces se añaden proteasas e inhibidores de fosfatasas que evitan la digestión de la muestra por las propias enzimas.
Para separar proteínas decompartimentos y orgánulos celulares es preciso combinar técnicas mecánicas - como filtraciones y centrifugaciones - y bioquímicas.
[pic]
Electroforesis en gel
Las proteínas de la muestra serán separadas mediante una electroforesis en gel en función de uno o varios de estos criterios: punto isoeléctrico, peso molecular y carga eléctrica. La naturaleza de la separación depende del tratamiento de la muestray de la naturaleza del gel.
La electroforesis en gel más frecuente hace uso de gel de poliacrilamida y de tampón con dodecilsulfato (SDS), en la electroforesis conocida como SDS-PAGE. En esta técnica las proteínas sufren un tratamiento por agentes reductores que provocan la pérdida de las estructuras secundaria y terciaria de las proteínas (por ejemplo, reduciendo los puentes disulfuro (S-S) agrupos tiol (SH + SH)) y mantiene los polipéptidos en este estado desnaturalizado. De esta modo, la estructura tridimensional de las proteínas no influye en la electroforesis, y pueden separarse únicamente en función del tamaño.
Transferencia
Para que las proteínas sean accesibles a la detección por anticuerpos, se las transfiere desde el gel de poliacrilamida a una membrana de nitrocelulosa o dePVDF. Esta transferencia puede realizarse por difusión o por acción de un campo eléctrico (electrotransferencia).
Las membranas que se emplean en el Western blot se caracterizan por su capacidad de unir proteínas de forma inespecífica (es decir, se adhieren a todas las proteínas con idéntica afinidad). La unión está basada en interacciones hidrofóbicas y de cargas entre la membrana y lasproteínas. Las membranas de nitrocelulosa son más baratas que las de PVDF, aunque son también más frágiles y no soportan bien repetidas pruebas.
Difusión simple
En la transferencia por difusión simple se ponen en contacto las superficies del gel electroforético y de la membrana y, sobre ésta, se dispone un taco de papeles de filtro. Con el fin de facilitar el proceso, puede ponerse encima una placa de...