Microscopia Confocal

MICROSCOPIA CONFOCAL

Dr. Carlos Sánchez Martín Servicio de Microscopía Optica y Confocal Centro de Biología Molecular Severo Ochoa Universidad Autónoma de Madrid

INDICE

1. INTRODUCCIÓN Y ANTECEDENTES............................................................................................................. 3 2. TIPOS YCARACTERISTICAS............................................................................................................................ 4 3. VENTAJAS Y DESVENTAJAS ............................................................................................................................ 8 4. ASPECTOS PRACTICOS ...................................................................................................................................... 9 5.APLICACIONES DE LA MICROSCOPIA CONFOCAL .............................................................................12 6. PERSPECTIVAS FUTURAS ...............................................................................................................................16 7. EJEMPLOS DE LO QUE SE PUEDE OBTENER ..........................................................................................17 8.BIBLIOGRAFÍA ....................................................................................................................................................18 9. INTERNET..............................................................................................................................................................18 10. LISTA DE LOS FLUORÓFOROS DISPONIBLES......................................................................................19

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1. INTRODUCCIÓN Y ANTECEDENTES La microscopía Confocal es una mejora sustancial de las técnicas clásicas de microscopía óptica (campo claro y fluorescencia), resultando de gran interés para diversas ramas de la ciencia tales como medicina, biología, materiales, geología, etc. Su éxito se debe a la obtención de imágenes demayor nitidez y contraste, mayor resolución vertical y horizontal y a la posibilidad de obtener “secciones ópticas” de la muestra, permitiendo su estudio tridimensional. En las técnicas clásicas de observación en microscopia óptica, la luz interacciona con la muestra a varias profundidades por lo que la imagen que llega al observador presenta áreas borrosas debido a la luz procedente de zonas fueradel plano de enfoque, lo que produce una degradación en el contraste y resolución de la imagen. El principio de la microscopía Confocal se basa en e liminar la luz reflejada o fluorescente procedente de los planos fuera de foco. Para ello se ilumina una pequeña zona de la muestra y se toma el haz luminoso que proviene del plano focal, eliminándose los haces procedentes de los planos inferiores ysuperiores.

Figura 1 La invención del primer microscopio Confocal se le suele atribuir a Marvin Minsky, quien en 1955 diseñó un microcopio que le permitía observar redes neuronales en preparaciones de tejido nervioso no teñidas. La mayoría de los sistemas confocales modernos se basan en el principio por él patentado en 1957 (http://web.media.mit.edu/~minsky). Su diseño original se basaba en lapresencia de dos “pinhole”: uno situado 3

entre la fuente de luz y el objetivo, y otro entre el objetivo y un fotomultiplicador (Fig.1). Ambos debían estar perfectamente alineados (confocalizados), de manera que el segundo de ellos no dejara pasar al fotomultiplicador toda la luz “fuera del plano focal”, que es la base de todo sistema Confocal. Sin embargo, la tecnología aún no disponible porentonces no le permitió demostrar todo el potencial de esta nueva técnica de microscopía, sobre todo en lo referente a muestras biológicas. Ha sido el espectacular desarrollo de la tecnología láser, de la informática y de los sistemas de adquisición digital de imagen lo que ha permitido conocer todas las posibilidades de la microscopía Confocal e implantar su uso generalizado en el campo de la...