OBTENCIÓN Y TRATAMIENTO DE MUESTRAS PARA CUANTIFICACIÓN DE SU CONTENIDO PROTEICO
Páginas: 5 (1183 palabras)
Publicado: 30 de noviembre de 2013
MEMORIA PRÁCTICA 1 DE BIOLOGÍA.
OBTENCIÓN Y TRATAMIENTO DE MUESTRAS PARA CUANTIFICACIÓN DE SU CONTENIDO PROTEICO
el objetivo de nuestra practica fue la de tomar un trozo de un alimento (en nuestro casa naranja) y realizar un Homogeneizado y separado a partir de centrifugado diferencial, para determinar la concentración proteínica de dicha muestra. También tomaremos otra muestra dela misma naranja para calcular su porcentaje de agua.
Material:
Para ello, hemos utilizado:
-Fruta (naranja)
- Homogeneizador de vidrio o vidrio-teflón.
- Tampón de homogeneización (Tris-Mes 50 mM, pH 7,5; EDTA 5 mM, DTT 5mM y PMSF 0.5 mM).
- Tubos cónicos y eppendorf, pipetas de vidrio Pasteur y automáticas, pinzas, placas de Petri, para preparar las muestras para el centrifugado yhomogeneizado.
- Centrífuga de mesa
-Balanza granatario para determinar su peso en seco y después de homogenizada.
-Estufa de desecación para comprobar el peso del agua en la fruta.
- Muestras de las fracciones
- Proteína de referencia o patrón: BSA (albúmina sérica bovina) 1mg/ml, para poder evaluar la concentración.
-Tubos de espectrofotómetro, pipetas automáticas.
- Agua bidestilada-Agitador mecánico (vortex), para mezclarlo.
- Espectrofotómetro (Luz visible), para determinar la concentración de proteínas a partir de la luz que pasa a través del líquido, poniendo unos valores estándares.
-Reactivos A, B, C, y D para la determinación colorimétrica:
REACTIVO A: NaOH 4g/L; NaCO3 20g/L; Tartrato NaK 1 g/L
REACTIVO B: CuSO4.5H2O 1g/L
REACTIVO C: A+B en proporción 49:1REACTIVO D: agua bidestilada + Reactivo Folin comercial (1:1)
Métodos:
1)- lo primero que hicimos fue partir la naranja en dos trozos de aproximadamente 5 gramos y anotar su peso en fresco. Luego, uno de esos trozos lo introducimos en la estufa de desecación, en la cual dejaríamos uno de ellos varios días con el fin de que se evaporara toda el agua que contiene la muestra y pudiéramosver el peso de ésta respecto a la fruta normal. y también conocer el porcentaje de agua.
en el segundo paso, tomamos el otro trozo de fruta y lo introducimos en el homogeneizador y después de administrar 5 mL de tampón de homogeneizado, lo homogeneizamos durante 5-10 minutos, después se extrae en un tubo cónico y con lo que ha quedado en el homogeneizador, se vuelve a extraer con 2 mLde tampón, hasta llegar a 10mL.
en el tercer paso se utilizó la centrifuga de mesa (algo nuevo para mi, ya que no lo había utilizado hasta ahora). Centrifugamos a 1.800 rpm durante 5 minutos, y nos quedado un pellet (que es algo como una papilla) con el material pesado abajo y un sobrenadante arriba, que se compone del material homogeneizado en suspensión. Debemos de anotar el peso delsobrenadante y transferirlo a un tubo cónico limpio graduado. Tomamos una muestra de 500 µL la cual etiquetamos para introducirla en un congelador a -80 ºC hasta que lo tengamos que usar. (en este paso he incluido los pasos finales)
2)- En la segunda parte de la práctica debíamos preparar una recta patrón para comparar los resultados que obtengamos en el espectrofotómetro. (este paso lo realizóuna compañera) los tubos para la recta patrón serán por duplicado y con contenido de 0 a 200 µg de BSA en un volumen final de 300 μl de agua. Este patrón fue el mismo para todos.
Una vez realizada la recta, debíamos preparar nuestros tubos por duplicado llamados (muestras problema) con un volumen final de 300 µl ( 100 µl de muestra + 200 µl de agua) Después añadimos a todos los tubos (losnuestros y los utilizados en la recta patrón) 3mL del reactivo C. agitamos y dejamos 10 minutos a temperatura ambiente. Luego añadimos 300 µl del reactivo D, después agitamos y dejamos esta vez 30 minutos a temperatura ambiente. por último medimos la absorbancia a 700 nm por duplicado en el espectrofotómetro y anotar los resultados.
Estos fueron nuestros resultados: Muestra de...
OBTENCIÓN Y TRATAMIENTO DE MUESTRAS PARA CUANTIFICACIÓN DE SU CONTENIDO PROTEICO
el objetivo de nuestra practica fue la de tomar un trozo de un alimento (en nuestro casa naranja) y realizar un Homogeneizado y separado a partir de centrifugado diferencial, para determinar la concentración proteínica de dicha muestra. También tomaremos otra muestra dela misma naranja para calcular su porcentaje de agua.
Material:
Para ello, hemos utilizado:
-Fruta (naranja)
- Homogeneizador de vidrio o vidrio-teflón.
- Tampón de homogeneización (Tris-Mes 50 mM, pH 7,5; EDTA 5 mM, DTT 5mM y PMSF 0.5 mM).
- Tubos cónicos y eppendorf, pipetas de vidrio Pasteur y automáticas, pinzas, placas de Petri, para preparar las muestras para el centrifugado yhomogeneizado.
- Centrífuga de mesa
-Balanza granatario para determinar su peso en seco y después de homogenizada.
-Estufa de desecación para comprobar el peso del agua en la fruta.
- Muestras de las fracciones
- Proteína de referencia o patrón: BSA (albúmina sérica bovina) 1mg/ml, para poder evaluar la concentración.
-Tubos de espectrofotómetro, pipetas automáticas.
- Agua bidestilada-Agitador mecánico (vortex), para mezclarlo.
- Espectrofotómetro (Luz visible), para determinar la concentración de proteínas a partir de la luz que pasa a través del líquido, poniendo unos valores estándares.
-Reactivos A, B, C, y D para la determinación colorimétrica:
REACTIVO A: NaOH 4g/L; NaCO3 20g/L; Tartrato NaK 1 g/L
REACTIVO B: CuSO4.5H2O 1g/L
REACTIVO C: A+B en proporción 49:1REACTIVO D: agua bidestilada + Reactivo Folin comercial (1:1)
Métodos:
1)- lo primero que hicimos fue partir la naranja en dos trozos de aproximadamente 5 gramos y anotar su peso en fresco. Luego, uno de esos trozos lo introducimos en la estufa de desecación, en la cual dejaríamos uno de ellos varios días con el fin de que se evaporara toda el agua que contiene la muestra y pudiéramosver el peso de ésta respecto a la fruta normal. y también conocer el porcentaje de agua.
en el segundo paso, tomamos el otro trozo de fruta y lo introducimos en el homogeneizador y después de administrar 5 mL de tampón de homogeneizado, lo homogeneizamos durante 5-10 minutos, después se extrae en un tubo cónico y con lo que ha quedado en el homogeneizador, se vuelve a extraer con 2 mLde tampón, hasta llegar a 10mL.
en el tercer paso se utilizó la centrifuga de mesa (algo nuevo para mi, ya que no lo había utilizado hasta ahora). Centrifugamos a 1.800 rpm durante 5 minutos, y nos quedado un pellet (que es algo como una papilla) con el material pesado abajo y un sobrenadante arriba, que se compone del material homogeneizado en suspensión. Debemos de anotar el peso delsobrenadante y transferirlo a un tubo cónico limpio graduado. Tomamos una muestra de 500 µL la cual etiquetamos para introducirla en un congelador a -80 ºC hasta que lo tengamos que usar. (en este paso he incluido los pasos finales)
2)- En la segunda parte de la práctica debíamos preparar una recta patrón para comparar los resultados que obtengamos en el espectrofotómetro. (este paso lo realizóuna compañera) los tubos para la recta patrón serán por duplicado y con contenido de 0 a 200 µg de BSA en un volumen final de 300 μl de agua. Este patrón fue el mismo para todos.
Una vez realizada la recta, debíamos preparar nuestros tubos por duplicado llamados (muestras problema) con un volumen final de 300 µl ( 100 µl de muestra + 200 µl de agua) Después añadimos a todos los tubos (losnuestros y los utilizados en la recta patrón) 3mL del reactivo C. agitamos y dejamos 10 minutos a temperatura ambiente. Luego añadimos 300 µl del reactivo D, después agitamos y dejamos esta vez 30 minutos a temperatura ambiente. por último medimos la absorbancia a 700 nm por duplicado en el espectrofotómetro y anotar los resultados.
Estos fueron nuestros resultados: Muestra de...
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