Pcr accion de la polimerasa en cadena

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Objetivo: Amplificación in vitro de un fragmento de ADN específico mediante PCR

Introducción

En 1983, Kary Mullis, investigador de la compañía Cetus, diseña y patenta un método para la amplificación de secuencias específicas de DNA, al que se ha denominado PCR, siglas de reacción en cadena de la polimerasa en inglés. Esta técnica, desarrollada enlos últimos años, ha tenido un impacto revolucionario en los estudios y el diagnóstico molecular. Prueba de ello son las múltiples publicaciones aparecidas desde su descripción, así como las cada vez mayores aplicaciones de la misma, tanto en el área de la medicina como de la biología.
La PCR es una técnica enzimática que nos permite fabricar in vitro un número teóricamente ilimitado de copiasde una secuencia de DNA conocida, gracias a la repetición cíclica de tres pasos o reacciones simples en las que sólo varía la temperatura de incubación. Esto supone disponer de forma rápida y eficaz de cantidades suficientes de una determinada secuencia de DNA para su posterior estudio molecular.

Conceptualmente, la PCR es un método simple de síntesis de ácidos nucleicos in vitro, en el que elnúmero de moléculas generadas se duplica tras cada ciclo del proceso, de tal forma que si se empieza con una sola doble cadena de DNA, después de 20 ciclos dispondríamos de un millón de copias del fragmento amplificado. Para su realización se requieren unos reactivos básicos, que se someten a diferentes cambios cíclicos de temperatura. Estos son: la muestra o molde de DNA a amplificar, dosoligonucleótidos llamados cebadores o primers, cada uno de ellos completamentario a cada una de las hebras del DNA molde al que flanquean, con una corta distancia entre ellos; una cantidad abundante de los cuatro deoxinucleótidos trifosfatos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), un cofactor enzimático MgCl y una enzima, una DNA polimerasa, que se encargará del proceso de síntesis de las nuevas copias de DNA a partirdel DNA molde; recordemos que esta enzima debe disponer de su respectivo buffer para acondicionar el medio. Básicamente, el proceso se realiza mezclando los productos descritos en un tubo Eppendorf de 0,5 ml, al que sometemos a una serie de ciclos en los que varía la temperatura de incubación. Cada ciclo consta de tres pasos o reacciones:
1. Desnaturalización del DNA muestra bicatenario en los quese separan las dos hebras complementarias por calentamiento de las mismas a 95º C.
2. Renaturalización o unión de los cebadores a las secuencias complementarias del DNA muestra por descenso de la temperatura (entre 37o C y 60o C).
3. Polimerización, síntesis 0 extensión, en el que la temperatura (72º C) se adecua para que pueda actuar la enzima y copiar la hebra de DNA molde mediante laadición al extremo 3’ del cebador de los distintos deoxinucleótidos según las reglas de la complementariedad, sintetizándose el nuevo DNA en la dirección 5’ a 3’. Estos pasos se repetirán cíclicamente, de tal manera que después de cada ciclo habrá un crecimiento exponencial de las copias de DNA. Un incremento final de 2n, donde n es el número de ciclos. Todo este proceso está automatizado, requiriendosólo unas pocas horas desde el comienzo de los ciclos hasta el análisis del producto resultante.

Los reactivos
La enzima. Inicialmente, la enzima utilizada en la PCR era un fragmento de DNA polimerasa de E. coli, denominado fragmento de Klenow, cuya temperatura óptima de reacción es de 37º C. Esto obligaba a añadir una alícuota de enzima fresca tras cada desnaturalización, pues durante ésta latemperatura se eleva a unos 94º C durante casi un minuto y la enzima pierde su actividad. Este problema se solucionó en 1988 con la comercialización de una DNA polimerasa procedente de una bacteria termófila, Thermus aquaticus, que vive a temperaturas de 70-75º C en fuentes termales. La Taq polimerasa, como se la denomina, presenta una temperatura óptima de actuación entre 75-80º C, siendo...