Pcr y marcadores moleculares

PCR y marcadores moleculares
Biología Celular y Molecular Básica 2011-I Parte A

• Los rasgos heredados son determinados por genes los cuales son transmitidos de padres a hijos en la reproducción • Un gen puede mutar en muchas formas llamadas alelos

Conceptos claves

Fenotipo
• Fenotipo: Es la expresión física del conjunto de genes que controlan un rasgo en particular, de lainteracción entre éstos y de su interacción con el medio ambiente. E.j. color de cabello, color de ojos, altura, peso, etc • Los individuos de una especie se diferencian morfológicamente y esto es reflejo en alguna medida de diferencias a nivel genético

Fenotipo
• Dificultades para el estudio de las diferencias genéticas entre individuos con base en caracteres morfológicos: – Más de un gen controla unrasgo en particular. Esto se conoce como herencia poligénica – Un gen puede controlar más de un rasgo: esto se conoce como pleiotropía – Influencia de factores medioambientales • La variación genética entre individuos es detectada más fácilmente si estudiamos los genes directamente que si estudiamos los fenotipos

Marcador Genético
• Un marcador genético es cualquier diferencia que exista en lasecuencia de ADN entre individuos y se puede detectar de diversas maneras. Ej. Análisis de los productos de ese gen (proteínas) o análisis de la secuencia de ADN • Los marcadores de ADN son aquellos que se detectan por medio del análisis del ADN directamente. Ej. secuenciamiento

Métodos para detectar la variación genética
• Métodos basados en la generación de fragmentos de ADN, ej. RFLP •Métodos basados en la amplificación o replicación in vitro de regiones discretas del ADN: PCR, RAPDs, SSR • Métodos basados en la generación de fragmentos de ADN y en su amplificación: PCR-RFLP, AFLP

Generación de fragmentos de ADN
• Los primeros métodos que se desarrollaron para la detección de la variación genética se basaron en la longitud de fragmentos de ADN • Esta técnica no requiereconocimiento previo de la secuencia del ADN • Pasos: – Aislar o purificar el ADN total de cada individuo: esto genera fragmentos de 50 Kb (1 Kb=1000 pares de bases-bp) – “Cortar” el ADN en fragmentos más cortos – Separar los fragmentos por su tamaño por medio de la electroforesis

Las moléculas de ADN de diferentes tamaños se pueden separar por medio de electroforesis

Electroforesis
• • Cada regióndiscreta del gel donde se detecta ADN se denomina una banda Las bandas se visualizan al agregar al gel o a la muestra un agente como el bromuro de etidio el cual se une al ADN de doble cadena y lo hace brillar bajo luz ultravioleta Una banda representa una colección de fragmentos de ADN de la misma región del genoma (o tal vez de diferentes regiones del genoma) de un tamaño definido que migran enla misma posición en el gel

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RFLP (restriction fragment length polymorphisms)
• RFLP es una técnica para detectar variación en la secuencia de ADN por medio de la comparación de fragmentos de ADN • Pasos: – Extracción de ADN: se necesita una gran cantidad de ADN, cerca de 500 micro gramos (5x10-6 gr.) – Generación de fragmentos de ADN por corte con enzimas de restricción – Separación delos fragmentos por medio de electroforesis – Transferencia de los fragmentos a un medio fijo como una membrana de nylon – Hibridización de los fragmentos en la membrana con una secuencia corta de ADN llamada sonda – Visualización de los fragmentos

RFLP

Southern blotting
• Southern blotting es la transferencia de los fragmentos de ADN a partir del gel de agarosa a una membrana denitrocelulosa con el fin de inmovilizarlos y hacer la identificación de fragmentos específicos más fácil. El método fue creado por E.M. Southern en 1975

Hibridización de ácidos nucléicos
• A fin de que la sonda se hibridice con los fragmentos de ADN específicos, es decir, se una a cadenas de ADN complementarias a ella, es necesario desnaturalizar el ADN que se encuentra adherido a la membrana de...