Protocolo

Estraccion de DNA
Protocolo.
1. Centrifugar a 3000 rpm/min y eliminar sobrenadante
2. Resuspender el pellet en buffer TEG (tris hel. 10mM, EDTA 1mM y 50 mM deglucosa, pH 8,0) 200uL por muestra
3. Mezclar con un vortex y agregar la lisozima (descongelar con el calor de las manos) y dejar durante 30 min a baño maria a37ºC. La lisozima es una enzima que cataliza el rompimiento de los enlaces covalentes de la pared celular.
4. Agregar 10 uL de RNAsa e incubar a 37ºC durante 1 hora.La RNAsa es una enzima que hidroliza el RNA (ac. Ribonucleicos) para eliminar y evitar interferencia de este constituyente celular en el análisis final.
5.Agregar 10 uL de proteinza K e incubar a 56ºC por 1 hora. La proteína K es una enzima que media la hidrólisis de proteínas, de esta manera se mejora el rendimiento enla purificación del DNA.
6. Lavar con una mezcla de fenol, cloroformo, isoamilico (25:24:1) 1 volumen y centrifugar a 1300 rpm durante 5 min. (repetir 2 veces)conesta mezcla de solventes se extraen los restos celulares dejando solo el ADN en la fase superior del ependorff.
7. Lavar 1 vez con cloroformo (0.8 volumen) ycentrifugar a 1300 rpm durante 5 min.
8. Precipitar el producto con acetato de sodio 3M (0,1volumen (20uM)) y etanol frio (2,5 (200uM) volumen).
9. Dejar toda la nohea -24ºC y al dia siguiente centrifugar a 1300 rpm durante 5 min y eliminar.
10. Agregar 500uL de etanol al 70%, centrifugados a 1300 rpm durante 5 min yeliminar el sobrenadante.
11. Secar las muestras por 20-30 min en la estufa para eliminar los restos de etanol.
12. Resuspender el pellet en H2O miliQ esteril (80uL)