Purificacion de proteinas

0141BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL

Sección 2. ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE PROTEÍNAS

0141BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL

Sección 2. ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE PROTEÍNAS

2. ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE PROTEÍNAS. Purificación de la enzima lactato deshidrogenasa de músculo esquelético de bovino. PARTE I. EXTRACCIÓN Y PRECIPITACIÓN POR SALADO.
Objetivos - Conocer las propiedades físicoquímicas de lasproteínas: carga, punto isoeléctrico, masa molecular y afinidad. - Conocer las diferentes estrategias utilizadas para aislar proteínas a partir de diferentes fuentes celulares. - Relacionar las propiedades fisicoquímicas de las proteínas con el fundamento de las técnicas utilizadas en la purificación de proteínas: Centrifugación diferencial, precipitación por salado, cromatografía en filtración engel, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de afinidad. - Aplicar las técnicas de centrifugación y precipitación por salado como técnicas iniciales de purificación de una proteína. Introducción Una condición esencial para el estudio de la estructura y función de una proteína es su purificación, generalmente de un tejido que contiene miles de proteínas que difieren en tamaño, forma ycarga. Hay varios aspectos que deben considerarse para realizar un método para purificar una proteína, como por ejemplo, para que se usará la proteína, cuales son las características propias de la proteína (tamaño, carga, solubilidad, hidrofilicidad y función biológica), la cantidad que se requiere purificar y el costo. Por lo tanto, no hay un procedimiento único para la purificación de proteínas,no obstante, si hay una forma sistemática en la que se puede realizar. Una guía básica para la purificación de una proteína toma en consideración lo siguiente: A. Definir los objetivos de la purificación. Grado de pureza, cantidad y nivel de actividad requeridos. B. Seleccionar la muestra biológica de inicio. Dependerá de la localización de la proteína tanto en tejidos como en compartimentosextracelulares o intracelulares. C. Desarrollar una técnica de análisis. Para la determinación rápida de la pureza, actividad o contenido total de proteína. Un método frecuentemente utilizado para evaluar la pureza es la separación de la proteína mediante electroforesis. D. Minimizar la manipulación de la muestra. Evitar los procedimientos largos, ya que se corre el riesgo de perder la actividad de laproteína o reducir el rendimiento. E. Remover al inicio del proceso los posibles contaminantes. Como por ejemplo las proteasas. F. Reducir el uso de aditivos. El uso de muchos y diversos aditivos como sales y amortiguadores en cada paso, puede llevar a la pérdida de la actividad de la enzima y aumentar los costos de la purificación. Seleccionar y usar sólo lo necesario. G. Usar una técnicadiferente en cada paso. Para ello tomar en cuenta las propiedades fisicoquímicas de la proteína como tamaño, carga, hidrofobicidad y especificidad por ligandos. H. Minimizar el número de pasos. En cada paso se pierde proteína y tiempo, por lo que hay que combinar los pasos de manera lógica.

Un protocolo típico de purificación de una proteína intracelular utiliza varias técnicas, que pueden incluir enla primera fase, la ruptura de las membranas celulares, la centrifugación diferencial o en gradiente de densidad para separar proteínas de las partículas subcelulares o bien de agregados de diferente peso molecular. Una purificación posterior incluirá la precipitación selectiva de proteínas por la adición de sales o solventes miscibles en agua. En la tercera fase de la purificación se removeránlos contaminantes utilizando la separación basada en la carga, tamaño y afinidad de la proteína. A continuación se describen brevemente las tres fases del proceso y algunas técnicas para purificar una proteína. SELECCIÓN DE LA FUENTE DE LA PROTEÍNA. Varias pueden ser las fuentes de la proteína, microorganismos, tejidos, cultivos celulares, células transformadas1, entre otras. La elección de la...