quimica

ELISA
El uso de la técnica inmunoenzimática ELISA está ampliamente difundido para el diagnóstico serológico de enfermedades.
Este ensayo (ELISA) se basa en el uso de antígenos o anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunológica como enzimática pudiendo ser revelada mediante la adición de un substrato específico que, en contacto conla enzima, producirá un color observable a simple vista y cuantificable por un lector de densidad óptica.
La técnica de ELISA se caracteriza por presentar alta sensibilidad, especificidad y rapidez.
La prueba ELISA se basa en varias teorias:
1)El antígeno y anticuerpo pueden enlazarse a una superficie portadora insoluble y retener su reactividad inmunológica
2)las enzimas tienen actividadespecífica alta y convierten una cantidad relativamente grande de sustrato en producto detectable, lo que permite detectar concentraciones muy bajas del ligando
3) la actividad enzimática o reactividad inmunológica de los conjugados se preserva y permanece estable durante el análisis y el almacenamiento; y
4) las enzimas no están presentes en el líquido biológico que se va a analizar.
La enzimaescogida como marcador debe de unirse fácilmente a antígenos y anticuerpos y encontrarse en estado puro. Las enzimas más utilizadas son:
Fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano y ß-galactosidasa
El ELISA es una herramienta útil para determinar las concentraciones séricas de anticuerpos (ie VIH West Nile Virus), también ha encontrado aplicaciones en la industria alimentaria en la detección deposibles alérgenos alimentarios (leche, mani, nueces, almendras, huevo), y también se puede utilizar en toxicología comno pantalla rápida presuntiva de ciertas clases de drogas
Confirmación de presencia de anticuerpos: ac contra microorganismos, vacunas, autoanticuerpos
Cuantificación de metabolitos: hormonas, medicamentos, etc
Por ejemplo: medición de HGC, toxo, rubeola, VIH, chagas
Fasesde un ensayo ELISA
Las 4 fases de un ensayo ELISA son las siguientes:
1. Conjugación del anticuerpo o del antígeno con un enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina...). El anticuerpo conjugado a la enzima se emplea en los ensayos directos e indirectos, sandwich, etc. El antígeno marcado se emplea en ensayos de competición de antígeno.
2. Unión del antígeno (o del anticuerpo) a los pocillos. Launión de anticuerpos o antígenos se realiza con facilidad a la superficie de plásticos tratados que tienen gran afinidad por proteínas.
3. Formación de una o más capas de inmunocomplejos. En el caso del antígeno unido a la placa se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antígeno marcado (ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario anti-antígeno y un secundario anti primario marcado(ELISA indirecto). Este segundo método permite la amplificación de la señal al poderse unir uno o más anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. En el caso del anticuerpo unido a la placa se incuba con una mezcla de antígeno y antígeno marcado. Se ensayan diferentes relaciones de antígeno frío frente a una cantidad fija de antígeno marcado. Es el ensayo de competición del antígeno.
4.Revelado de la reacción enzimática. Después de un lavado para eliminar todos las moléculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos se añade el sustrato enzimático en solución. Se deja reaccionar y se lee la densidad óptica (D.O.) mediante espectrofotometría.
Tipos de ELISA
ELISA directo (ensayo ELISA simple de dos capas). Las placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las solucionesen las que se sospecha se encuentra el antígeno. Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la presencia de antígeno en la solución analizada. Es necesario incluir controles negativos que serán muestras del mismo tipo de las analizadas (sangre, orina,...) pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del antígeno buscado. Asimismo se incluyen controles positivos (soluciones donde se...