48 Transformación E Coli Con Plásmido Recombinante
Páginas: 6 (1477 palabras)
Publicado: 10 de febrero de 2013
48. Transformación de Escherichia coli con un plásmido recombinante
Aurora Galván Cejudo, Manuel Tejada, Antonio Camargo, José Javier Higuera, Emilio Fernández Reyes
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus Universitario de Rabanales, Edificio Severo Ochoa, 14071-Córdoba
RESUMEN
Se trabaja el principio de adquisición de información genética en bacterias mediante laintroducción de DNA plasmídico por transformación. Se trabaja la selección de clones celulares con las características esperadas de la expresión o ausencia de expresión de los genes marcadores presentes en un plásmido recombinante y se estima la eficiencia de la transformación. Asimismo, se preparan soluciones y medios de cultivos de bacterias y se utilizan en condiciones asépticas. Palabras clave:células competentes, transformación, β-galactosidasa. choque térmico, eficiencia de
Abreviaturas empleadas. ATP: trifosfato de adenosina; DNA: ácido desoxirribonucleico; mRNA: ácido ribonucleico mensajero; IPTG, isopropil-β-Dtiogalactopiranósido; X-gal: 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido.
1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS La transformación es un proceso por el cual las células captan DNAlibre presente en el medio. Es un fenómeno que ocurre de forma natural en muchas bacterias, pero la eficacia del proceso varía enormemente de unas especies a otras. Para que la transformación tenga lugar, la bacteria tiene que encontrarse en el llamado estado de competencia, que ocurre en determinadas condiciones fisiológicas; en este estado, la bacteria presenta alteraciones en su pared y membranacelulares, que permiten la entrada de ácidos nucleicos en la célula. En el laboratorio se ha conseguido poner a punto técnicas que inducen el estado de competencia en bacterias que no lo presentan de forma natural, como es el caso de E. coli. Estas técnicas se basan en diversos tratamientos químicos o físicos que producen microporos en la célula, lo que permite la introducción del DNA exógeno(transformación) de modo bastante eficiente. Uno de los métodos físicos es la electroporación, consistente en inducir la competencia mediante la aplicación de un pulso eléctrico muy breve e intenso. Dicha competencia se puede inducir con tratamientos químicos utilizando compuestos como el cloruro cálcico. Hay que tener en cuenta sin embargo que tras estos tratamientos no todas las células del cultivose hacen competentes.
1
La transformación en el laboratorio es una técnica rutinaria de enorme utilidad, que nos permite introducir prácticamente cualquier plásmido en su forma circular o superenrollada en casi cualquier tipo de bacteria. El método que se describe a continuación es, por su simplicidad, uno de los más utilizados para transformar E. coli. Para detectar la transformación, elDNA introducido llevará un marcador seleccionable en el medio adecuado.
El objetivo de esta práctica es introducir el plásmido recombinante obtenido en una reacción de ligación en la estirpe de Escherichia coli DH5α. Esta estirpe está modificada genéticamente de manera que es posible inducir en laboratorio la competencia de las células así como mantener el plásmido de forma estable en suinterior. Se usarán células competentes obtenidas por tratamiento químico con cloruro de calcio.
2. LISTADO DEL MATERIAL NECESARIO Tubos Eppendorf, micropipetas, puntas estériles, agua estéril, microcentrífuga, baño termostatizado.
3. PROTOCOLO A REALIZAR 3.1. Obtención de células competentes 1. Estriar las células de Escherichia coli DH5α en una caja Petri con medio PSI-a e incubar toda la noche a37ºC. 2. Inocular 5 ml de medio PSI-b con una colonia aislada (utilizar un matraz de 125 ml) e incubar a 37ºC hasta alcanzar una densidad óptica de 0,3 a 550 nm. 3. Inocular, con el cultivo anterior, 100 ml de medio PSI-b en un matraz de 1 litro precalentado a 37ºC. Incubar a 37ºC hasta alcanzar una densidad óptica de 0,48 a 550 nm. 4. Enfriar el matraz del paso anterior durante 5 minutos en...
Aurora Galván Cejudo, Manuel Tejada, Antonio Camargo, José Javier Higuera, Emilio Fernández Reyes
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus Universitario de Rabanales, Edificio Severo Ochoa, 14071-Córdoba
RESUMEN
Se trabaja el principio de adquisición de información genética en bacterias mediante laintroducción de DNA plasmídico por transformación. Se trabaja la selección de clones celulares con las características esperadas de la expresión o ausencia de expresión de los genes marcadores presentes en un plásmido recombinante y se estima la eficiencia de la transformación. Asimismo, se preparan soluciones y medios de cultivos de bacterias y se utilizan en condiciones asépticas. Palabras clave:células competentes, transformación, β-galactosidasa. choque térmico, eficiencia de
Abreviaturas empleadas. ATP: trifosfato de adenosina; DNA: ácido desoxirribonucleico; mRNA: ácido ribonucleico mensajero; IPTG, isopropil-β-Dtiogalactopiranósido; X-gal: 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido.
1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS La transformación es un proceso por el cual las células captan DNAlibre presente en el medio. Es un fenómeno que ocurre de forma natural en muchas bacterias, pero la eficacia del proceso varía enormemente de unas especies a otras. Para que la transformación tenga lugar, la bacteria tiene que encontrarse en el llamado estado de competencia, que ocurre en determinadas condiciones fisiológicas; en este estado, la bacteria presenta alteraciones en su pared y membranacelulares, que permiten la entrada de ácidos nucleicos en la célula. En el laboratorio se ha conseguido poner a punto técnicas que inducen el estado de competencia en bacterias que no lo presentan de forma natural, como es el caso de E. coli. Estas técnicas se basan en diversos tratamientos químicos o físicos que producen microporos en la célula, lo que permite la introducción del DNA exógeno(transformación) de modo bastante eficiente. Uno de los métodos físicos es la electroporación, consistente en inducir la competencia mediante la aplicación de un pulso eléctrico muy breve e intenso. Dicha competencia se puede inducir con tratamientos químicos utilizando compuestos como el cloruro cálcico. Hay que tener en cuenta sin embargo que tras estos tratamientos no todas las células del cultivose hacen competentes.
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La transformación en el laboratorio es una técnica rutinaria de enorme utilidad, que nos permite introducir prácticamente cualquier plásmido en su forma circular o superenrollada en casi cualquier tipo de bacteria. El método que se describe a continuación es, por su simplicidad, uno de los más utilizados para transformar E. coli. Para detectar la transformación, elDNA introducido llevará un marcador seleccionable en el medio adecuado.
El objetivo de esta práctica es introducir el plásmido recombinante obtenido en una reacción de ligación en la estirpe de Escherichia coli DH5α. Esta estirpe está modificada genéticamente de manera que es posible inducir en laboratorio la competencia de las células así como mantener el plásmido de forma estable en suinterior. Se usarán células competentes obtenidas por tratamiento químico con cloruro de calcio.
2. LISTADO DEL MATERIAL NECESARIO Tubos Eppendorf, micropipetas, puntas estériles, agua estéril, microcentrífuga, baño termostatizado.
3. PROTOCOLO A REALIZAR 3.1. Obtención de células competentes 1. Estriar las células de Escherichia coli DH5α en una caja Petri con medio PSI-a e incubar toda la noche a37ºC. 2. Inocular 5 ml de medio PSI-b con una colonia aislada (utilizar un matraz de 125 ml) e incubar a 37ºC hasta alcanzar una densidad óptica de 0,3 a 550 nm. 3. Inocular, con el cultivo anterior, 100 ml de medio PSI-b en un matraz de 1 litro precalentado a 37ºC. Incubar a 37ºC hasta alcanzar una densidad óptica de 0,48 a 550 nm. 4. Enfriar el matraz del paso anterior durante 5 minutos en...
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