Acido

INTRODUCCIÓN:

Purificación de la enzima lactato deshidrogenasa (LDH) de músculo esquelético de bovino.

Resumen: La purificación de proteínas es un proceso que requiere del uso de varias técnicas, cada una de las cuales explota cierta característica de la proteína de interés y se realiza en varios pasos. En este trabajo se realizó la purificación de LDH, mediante técnicas de purificaciónsencillas como fue la de extracción y precipitación por salado, filtración en gel y cromatografía de afinidad. Finalizando con el método de electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS que nos proporcionó el proceso de identidad de la LDH así como su purificación.

La purificación de proteínas es uno de los procesos esenciales en el laboratorio de biología molecular, bioquímica e incluso en laindustria. Es un paso necesario para la identificación y caracterización de las proteínas presentes en un tejido o bacteria, para encontrar una nueva proteína antes desconocida, para confirmar la expresión de un gen, para la elaboración de reactivos y un sinfín más de objetivos.
La elección de cada método de purificación depende en gran medida de las necesidades de cada experimento, lascaracterísticas de la muestra a tratar y el presupuesto y disponibilidad de materiales. Los métodos basados en la diferencia de carga aprovechan que una proteína está conformada de diversos y variados aminoácidos. Una proteína a un pH dado poseerá una carga neta otorgada por la proporción de aminoácidos ácidos, básicos o neutros que contenga y por la estructura tridimensional que adopte en el medio.
Otro grupode métodos muy populares para la separación de proteínas es el que se basa en el tamaño de cada proteína. En este caso, a una mezcla de proteínas se le somete a una desnaturalización rompiendo la estructura terciaria de la proteína, desdoblándose hasta que se homogenice su carga, de forma que la única diferencia entre las proteínas sea el peso molecular de las mismas. A la mezcla previamentetratada se le coloca en un gel separador de un tamaño de poro dado, las proteínas migrarán a lo largo del gel separándose estas por su tamaño y peso molecular. Las proteínas más pequeñas serán retenidas con mayor fuerza que con las de mayor tamaño y peso molecular.
Otros métodos de separación incluyen los basados en solubilidad en distintos medios y fuerzas iónicas, en afinidad e interacciones conotras proteínas, el uso de anticuerpos monoclonales y la ultracentrifugación.
Todos estos métodos presentan ventajas y características que deben ser tomadas en cuenta de acuerdo a las necesidades del experimento.

Los aminoácidos se pueden distinguir, por su comportamiento ácido-base en ácidos, básicos y neutros; esta propiedad está relacionada con su propiedad de donar o aceptar protones delmedio en que se encuentren. Una proteína a un pH dado poseerá una carga neta otorgada por la proporción de aminoácidos ácidos, básicos o neutros que contenga y por la estructura tridimensional que adopte en el medio. Una resina de intercambio iónico es un material insoluble que posee una carga eléctrica permanente. Si una mezcla de proteínas se hace pasar por una columna cromatográfica empacada conuna resina de intercambio iónico, cada proteína será retenida con una fuerza diferente en la columna dependiendo de la carga neta de la misma. Si se pasa un tampón con un gradiente controlado de pH se podrán ir obteniendo las proteínas de forma separada.

Para la cromatografía por afinidad se requiere el enlace covalente de un reactivo, llamado ligando por afinidad, con un soporte sólido.’ Losligandos por afinidad característicos son anticuerpos inhibidores de enzimas u otras moléculas que en forma reversible y selectiva se enlazan a las moléculas del analito en la muestra. Cuando esta última pasa por la columna, sólo son retenidas las moléculas que se unen de manera selectiva al ligando por afinidad. Las moléculas que no se unen atraviesan la columna con la fase móvil. Después de...