ADN RECOMBINANTE

¿Cómo cortar y pegar el ADN? Tijeras moleculares: enzimas de restricción
En 1975 Daniel Nathans y Hamilton O. Smith descubrieron un tipo de proteínas –las enzimas endonucleasas o enzimas de restricción- que actúan como “tijeras moleculares”, cortando la doble cadena de ADN a través del esqueleto de fosfatos sin dañar las bases. El descubrimiento de estas enzimas condujo a dichos microbiólogosal Nobel en 1978 y dio origen a la ingeniería genética.
Las enzimas de restricción son producidas por bacterias como método de defensa contra virus y degradan el ADN extraño.
A su vez, el propio genoma bacteriano está protegido contra sus enzimas de restricción mediante metilaciones (es decir, el agregado de un grupo metilo [-CH3)]) en un átomo específico de ciertos nucleótidos.
Estasmoléculas son indispensables para la ingeniería genética, ya que producen fragmentos que se pueden unir entre sí fácilmente (con la ayuda de un “pegamento molecular”: la enzima ligasa).
Las enzimas de restricción cortan dejando extremos cohesivos o romos. Los extremos cohesivos son generados cuando la enzima corta las dos hebras asimétricamente, dejando los extremos de cada hebra de simple cadenacomplementarios entre sí. Por otro lado, los extremos romos son generados cuando la enzima corta las dos hebras por el mismo lugar, generando dos extremos doble cadena.

Figura 1. Enzimas de restricción. Este tipo de endonucleasas puede dejar dos tipos de extremos. En el primer caso, el corte genera nucléotidos de simple cadena llamados extremos cohesivos. Estos extremos se pueden unir por medio deotra enzima, la ADN ligasa. En el segundo caso, se generan extremos doble cadena (extremos romos). Estos extremos también pueden ser unidos con la ayuda de una enzima ligasa pero, como no los extremos no son complementarios, la unión será más inespecífica.
Las enzimas de restricción permiten cortar el genoma de cualquier organismo en pequeños fragmentos llamados fragmentos de restricción. Lacolección de miles o millones de estos fragmentos se llama biblioteca génica.
¿Cómo introducir ADN recombinante en las bacterias?
Una vez que los biólogos encontraron cómo fabricar ADN recombinante usando enzimas de restricción y ligasas, el desafío siguiente fue cómo producir grandes cantidades de genes y cómo introducirlos en bacterias u otras células huésped. El primer problema fuesolucionado con el uso de plásmidos, pequeñas moléculas de ADN circular presente en muchas bacterias.
Los plásmidos contienen uno o más genes de resistencia a antibióticos y son capaces de autorreplicarse, ya que contienen una secuencia de iniciación. Esto les permite replicarse de manera independiente del ADN genómico.
Podemos crear una molécula de ADN recombinante usando un plásmido. Este procesoconsta de las siguientes etapas:
1. Cortamos el ADN circular del plásmido con enzimas de restricción, para generar extremos cohesivos.
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2. Cortamos el ADN que queremos multiplicar. Debemos asegurarnos de que los extremos del plásmido y los del ADN a insertar sean complementarios y puedan unirse.
3. Unimos el gen que queremos introducir (inserto) por medio de la enzima ADN-ligasa y luegointroducimos el plásmido con inserto en bacterias.
4. Seleccionamos las bacterias que hayan introducido el plásmido con la ayuda de antibióticos. Dado que los plásmidos contienen un gen de resistencia a antibiótico, al exponer las bacterias a ese antibiótico, sólo las que hayan incorporado el plásmido (y con él la resistencia) sobrevivirán, mientras que las que no lo tengan morirán.
Esta es unamanera relativamente eficaz de obtener millones de copias del ADN incorporado. Dado que todas las copias del gen provienen de una sola molécula multiplicada a partir de una única bacteria que dio origen a la colonia, esta técnica lleva el nombre de clonación. El término clon proviene de la jardinería; desde hace siglos los jardineros generan plantas nuevas a partir de gajos. Estas plantas son...