Adn Recombinante

TECNOLOGÍAS DEL ADN RECOMBINANTE

Durante mucho tiempo los ácidos nucleicos resultaron incomprensibles: su increíble tamaño y su monótona secuencia de bases parecían obstáculos insuperables en el camino del análisis molecular de los genes. Con la llegada de nuevos métodos bioquímicos, esta situación ha cambiado por completo: hoy en día los ácidos nucleicos son más sencillos de explorar quecualquier otra molécula compleja de las células. El motor de estos rápidos cambios es el desarrollo de nuevas técnicas semiautomatizadas que permiten una identificación segura, una multiplicación rápida y una reestructuración prácticamente arbitraria de los ácidos nucleicos. La ampliación y el perfeccionamiento del abanico de métodos genético-moleculares han renovado la investigación en biomedicina.En este capítulo queremos tratar los métodos con los cuales se puedan reconocer, separar, multiplicar y modificar los ácidos nucleicos. Las manipulaciones de la biología molecular permiten la fabricación de proteínas recombinantes que actúan de fármacos o vacunas sin apenas límites. La transferencia genética en los oocitos fecundados posibilita la obtención de animales transgénicos; la deleción ola modificación genética dirigida permite crear modelos animales de enfermedades humanas. Tras un esfuerzo excepcional, en el año 2001 se consiguió presentar un primer diseño de la secuencia del genoma humano, que nos sirve como sistema de navegación en el descubrimiento de nuevos genes, en la localización de defectos genéticos y, cómo no, en el análisis funcional de los productos genéticos.Empezamos nuestra expedición a través de los métodos y técnicas de biología molecular de rotura dirigida de los ácidos nucleicos.

1. Las endonucleasas de restricción rompen el DNA en lugares definidos:

Las moléculas de DNA pueden tener medidas extraordinarias; los cromosomas humanos contienen cadenas de DNA alineadas hasta 3 x 108 bp. El genoma procariótico en forma de anillo esconsiderablemente menor, pero contiene aun unos 106 bp. Por tanto, un paso decisivo al principio de un análisis de DNA es el desmembramiento enzimático de los ácidos nucleicos en fragmentos manejables. Las endonucleasas que rompen DNA fragmentan la hebra de ácidos nucléicos en muchos lugares. Por el contrario, las endonucleasas de restricción, llamadas también enzimas de restricción, rompen la doble hebra solosi reconocen una secuencia seleccionada: poseen pues una especifidad de rotura “restrictiva”. Las endonucleasas de restricción son de origen bacteriano. Normalmente cortan la doble hebra de DNA en puntos característicos que a menudo presentan secuencias palindrómicas de cuatro, seis u ocho nucleótidos de longitud. Según la posición del corte, las endonucleasas de restricción producen extremossuaves o extremos sobresalientes de la doble hebra. El tamaño de la secuencia de reconocimiento de una endonucleasa de restricción define la secuencia de corte media: una enzima que reconoce una secuencia de cuatro pares de bases cortas estadísticamente con una frecuencia de 1 : 44, es decir, una media de una vez cada 256 nucleótidos. Las enzimas de restricción con preferencia por una secuencia dehexanucleótidos cortan en cambio con una frecuencia de 1 : 46 , es decir, una media de uno cada 4 096 nucleótidos.
Una aplicación importante de estas enzimas es el digerido de restricción del DNA. Una enzima de restricción rompe un DNA aislado dependiendo de la cantidad de secuencias de reconocimiento en un número definido de fragmentos. Si, por ejemplo se dirige en DNA de un fago-lambda con laenzima Hind III , que reconoce la secuencia destino AAGCTT y que se encuentra siete veces en el DNA del fago, se obtienen ocho fragmentos diferentes que se pueden examinar electroforéticamente. Los ácidos nucleicos tienen una elevada carga negativa debido a sus grupos fosfato: a pH fisiológico están disponibles como aniones, que en un campo eléctrico corren en dirección al ánodo. Si se usa un gel...